[發明專利]一種抗菌肽的制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310245373.0
• 申請日: 2013-06-19
• 公開（公告）號: CN103468673A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 凌建群;孟廣榮;姜超;謝雯凡;唐啟慧
• 申請（專利權）人: 江蘇吉銳生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;A01N47/44;A01P1/00;A61K38/10;A61K8/64;A61P31/04;A61Q11/00
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 汪旭東

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種抗菌肽的制備方法和應用。

背景技術

農桿菌介導法以其操作簡單、適用范圍廣、轉化效率高等優點廣泛應用于植物基因工程領域，具有很高的認同度。但同時，轉化后殘留的農桿菌對后續工作的不良影響也日益突顯。獲得轉化植株后，農桿菌在植株體內的殘存狀況，不僅影響到轉化植株的存活率、PCR檢測結果的可信度，而且還可能引起外源基因的遺傳漂移，導致環境問題。

當前，研究人員都采用抗生素來去除殘留的農桿菌，但不能完全清除農桿菌，進而影響愈傷組織的生長和分化，影響實驗效率。對于廣大科研工作者來說，找到一種有效的抗菌活性成分來替代抗生素的使用，解決農桿菌在轉基因組織培養過程中和轉化植株上的殘留問題是研究的重點。

傳統抗生素的大量使用造成耐藥菌株不斷產生，使得許多曾經高度有效的抗生素藥物失效，因此尋求新的抗生素越來越重要。人們發現，生物受到微生物感染后，迅速、大量產生具有抗菌活性的小分子多肽（即抗菌肽）參與機體免疫?？咕膸缀跏撬猩锓N都有的重要免疫分子，具有廣譜抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲及抗腫瘤等生物活性。目前已從微生物、植物、昆蟲、節肢動物、兩棲動物、哺乳動物甚至人體內鑒定出上千種抗菌肽，這些抗菌肽的發現為發展新型肽類抗生素提供了豐富的資源。其獨特的作用方式使其有望解決傳統抗生素長期使用帶來的細菌耐藥性問題，在醫藥衛生、農業生產、食品工業等領域都有廣泛的應用前景。

天然抗菌肽由于活性較低或是存在對宿主哺乳動物的細胞毒性等，并不能直接用作抗生素藥物?？咕漠a量低,天然中分離難度大,且化學合成成本過高，因此,如何提高抗菌肽的生產效率,降低生產成本,是應用抗菌肽必須解決的問題。而通過基因工程技術則可以解決這一問題,主要是利用分子克隆技術克隆抗菌肽基因或進行適當的改造,然后將這些優良基因導入適當的宿主菌,進一步篩選出高產菌株,以達到提高抗菌肽產量的目的。國外,早在1989年Jaynes就成功地利用基因工程技術在大腸桿菌中融合表達了抗菌肽基因；1991年,Andersons等利用多角體病毒表達系統在昆蟲細胞系中表達了抗菌肽基因；1993年,Piers等將抗菌肽基因在大腸桿菌中進行表達,通過對表達產物的產量、細胞定位、蛋白降解情況的系統研究,得到了具有抗菌活性的小肽。國內,對抗菌肽的研究起步較晚,但也取得了一定的進展,1999年沈國卿等成功地在酵母中表達了抗菌肽基因。

然而，基因工程表達抗菌肽存在的問題主要有：抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，缺乏檢測抗菌肽方法，基因的表達產物可能對宿主有害。因此，設計出活性更高、更有針對性而對宿主細胞無毒的肽類抗生素成為熱點。

發明內容

天然抗菌肽資源有限,且提取工藝復雜,成本昂貴，化學合成法成本太高,產業化困難,同時難以保證合成肽類的生物活性。抗菌肽分子量較小且容易被蛋白酶水解,分離純化工藝復雜,通?；虮磉_產量不高。本發明針對上述問題提供了用基因工程方法表達抗菌肽的方法，步驟簡便易操作，不需要大型設備，大大降低了純化成本，提高了得率。

本發明具體技術方案如下：

一種抗菌肽的基因，編碼SEQ?ID?NO.1所述的氨基酸序列的抗菌肽GBB，具有如SEQ?ID?NO.2所述的核苷酸序列。由于三位密碼子在編碼對應的氨基酸時，第三位堿基具有簡并性的特點，可從SEQ?ID?NO.1所述的氨基酸序列反推得到GBB的核苷酸序列，不限于SEQ?ID?NO.2-4任一所述的核苷酸序列：

SEQ?ID?NO.2：

GGACGATTTAAACGGTTTCGGAAAAAATTTAAGAAACTATTTAAGAAATTGTCATGA

SEQ?ID?NO.3：

GGACGATTCAAGCGGTTCCGGAAGAAGTTCAAGAAGCTATTCAAGAAGTTGTCATGA

SEQ?ID?NO.4：

GGACGATTTAAGCGGTTTCGGAAGAAGTTTAAGAAGCTATTTAAGAAGTTGTCATGA

本發明還提供了一種上述抗菌肽的制備方法，包括如下步驟：

（1）構建如SEQ?ID?NO.2-4所述的核苷酸序列表達系統，包括構建表達載體并將表達載體轉化入宿主細胞，形成可表達抗菌肽的重組細胞；

（2）培養重組細胞，使其表達抗菌肽；

（3）分離純化表達產物，得到具有SEQ?ID?NO.1所述的氨基酸序列的抗菌肽。