[發明專利]在Pichia pastoris中組成型表達菌絲霉素衍生物MP1102的方法

有效

• 申請號: 201310244829.1
• 申請日: 2013-06-19
• 公開（公告）號: CN103333912A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 王建華;張勇;滕達;王秀敏;毛若雨
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K14/39
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

1.一種表達載體，其特征在于，含有畢赤酵母組成型啟動子GAP、位于啟動子下游的編碼信號肽的核苷酸序列、編碼菌絲霉素衍生物MP1102的基因序列和TAA，TAG終止子序列，所述編碼MP1102的DNA序列5’端具有酵母Kex2切割識別序列AAGAGA。

2.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述菌絲霉素衍生物MP1102的氨基酸序列如SEQ?IDNo.1所示；優選地，所述編碼菌絲霉素衍生物MP1102的核苷酸序列如SEQ?IDNo.2所示。

3.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，載體所用信號肽為α-因子分泌信號肽α-MF，釀酒酵母轉化酶信號肽SUC2，畢赤酵母堿性磷酸酶信號肽PHO1或所需表達基因自身信號肽序列。

4.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述載體在編碼信號肽的核苷酸序列的3’端連接有XhoI酶切位點；在編碼MP1102的DNA序列的3’端連接有XbaI酶切位點。

5.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于，載體所用Kex2切割位點氨基酸信息為KR，或在Kex切割位點N/C-端添加EAEA及其相似序列。

6.根據權利要求1-5任一項所述的載體，其特征在于，所述載體為重組表達載體pGAPMP1102，其構建方法包括如下步驟：

（1）設計并合成如下基因片段：在甘油醛3’-磷酸脫氫酶啟動子GAP序列5’端添加酶切位點BglII，在3’端依次添加α-因子分泌信號肽序列和XhoI酶切位點；

（2）用限制性內切酶BglII和XhoI分別對合成的基因片段和載體pUC57進行雙酶切，回收pUC57載體片段和GAP啟動子+α-因子分泌信號肽片段，連接，得到載體pUCGAP；

（3）用限制性內切酶XhoI和XbaI分別對MP1102基因片段和載體pPICZαA進行雙酶切，回收pPICZαA載體片段和MP1102基因片段，連接，得到載體pPICMP1102；

（4）用限制性內切酶BglII和XhoI分別對載體pUCGAP和pPICMP1102進行雙酶切，回收pPICMP1102載體片段和GAP啟動子+α-因子分泌信號肽片段，連接，得到重組表達載體pGAPMP1102。

7.含有權利要求1-6任一項所述表達載體的宿主細胞；優選地，所述宿主細胞為酵母屬細胞；進一步優選地，所述宿主細胞為畢赤酵母基因工程菌；最優選地，所述宿主細胞為畢赤酵母X-33基因工程菌。

8.根據權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有分泌通路因子Bip、PDI、Sec63、YDJ1p或Ssa1p共表達系統；優選地，所述宿主細胞為重組畢赤酵母X-33基因工程菌Pichia?pastorisX-33/GAPMP02，其構建方法為將權利要求6所述的重組表達載體pGAPMP1102用限制性內切酶AvrII作線性化處理，然后轉化畢赤酵母X-33，獲得重組畢赤酵母X-33基因工程菌。

9.一種在重組畢赤酵母中表達菌絲霉素衍生物MP1102的方法，其特征在于，將權利要求8所述的重組畢赤酵母Pichia?pastorisX-33/GAPMP02發酵培養，分泌產生菌絲霉素衍生物MP1102。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述發酵培養的方法為轉化子搖瓶水平組成型表達培養或轉化子發酵罐高密度組成型表達培養；

其中，轉化子搖瓶水平組成型表達培養的方法如下：

挑取陽性轉化子，接種至YPD液體培養基，30℃，250rpm振蕩培養18-20h；0.5-1%接種量轉接至50mL?YPD液體培養基，30℃，250rpm振蕩培養1d后，以4層滅菌紗布替換玻璃紙封口膜包裹搖瓶口，30℃，250rpm振蕩培養3-5d至發酵結束；

其中，轉化子發酵罐高密度組成型表達培養的方法如下：

（1）種子液的制備及接種上罐

挑取陽性轉化子，接種至含100μg/mL?Zeocin的YPD液體培養基，30℃，250rpm振蕩培養18-20h；0.5-1%接種量轉接至YPD液體培養基，30℃，250rpm振蕩培養至OD600為4-6，火焰保護下接種至含基礎鹽培養基及終濃度為4.8‰PMT1的SARTORIUS發酵罐中；維持發酵罐轉速800rpm，pH5.0，通氣量8L/min，溶氧維持于20%以上，培養溫度29℃；

（2）菌體的補料生長和產物的組成型表達

觀測溶氧值下降后突然上升，調整發酵液pH值為5.5，轉速為1000rpm并開始補加含有12‰PMT1的50%葡萄糖，補加過程由0h的1mL?L^-1h^-1線性增加到6h的3-3.5mL?L^-1h^-1，直至5天后發酵結束。