[發明專利]在Pichia pastoris中組成型表達菌絲霉素衍生物MP1102的方法

有效

• 申請號: 201310244829.1
• 申請日: 2013-06-19
• 公開（公告）號: CN103333912A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 王建華;張勇;滕達;王秀敏;毛若雨
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K14/39
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及利用組成型啟動子P_GAP在重組畢赤酵母中高效表達菌絲霉素衍生物MP1102的方法。?

背景技術

菌絲霉素Plectasin是Mygind研究組利用從歐洲北部松林中分離出的腐生子囊類真菌Pseudoplectania?nigrella構建cDNA文庫，通過BLASTX和SSEARCHp序列相似性搜索程序，篩查到的具有高效抗G⁺菌活性抗菌肽。Plectasin基因編碼含有95個氨基酸殘基的多肽序列，其1-23是信號肽序列，24-55位為前導肽序列，56-95位為成熟肽（Plectasin）序列。Plectasin理論分子量為4407.9Da，具有六個組氨酸（His）和五個賴氨酸（Lys），在不同pH環境中，由于組氨酸解離狀態不同，Plectasin的凈電荷數在+1到+3之間變化(Mygind?等，Plectasin?is?a?peptide?antibiotic?with?therapeutic?potential?from?a?saprophytic?fungus.Nature,2005,437(7061):975-980)。?

Plectasin對革蘭氏陽性細菌具有強烈殺傷作用。Mygind等研究了Plectasin對130余株不同來源肺炎鏈球菌的抑制作用，發現對于青霉素敏感或抗性菌株，最小殺菌濃度（MIC）均在0.028-1.818μM之間，MIC₅₀為0.227μM。Gottlieb等（2008）研究Plectasin對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus）殺菌能力，MIC值介于0.227和7.273μM，MIC₅₀為1.82μM(Gottlieb等，Antimicrobial?peptides?effectively?kill?a?broad?spectrum?of?Listeria?monocytogenes?and?Staphylococcus?aureus?strains?independently?of?origin,sub-type,or?virulence?factor?expression.BMC?Microbiol,2008,8(1):205-214)。此外，Novozymes以Plectasin為母體，經易錯PCR構建突變文庫，從274個突變體中篩選到抗菌性?能大幅提高的突變體NZ2114，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）臨床分離菌株平均MIC僅為0.227μM，并且對耐萬古霉素腸球菌（VRSA）也具有很強的抑制作用，MIC值僅為0.455-0.91μM。此外，殺菌動力學實驗證明，Plectasin具有高效殺菌能力，5×MIC?Plectasin在5h內能夠殺滅99.9%供試病原菌。小鼠腹腔感染模型顯示，10mg/kg?Plectasin5h內殺菌效率相當于70mg/kg萬古霉素，腹腔中病原菌數量減少3個數量級（相當于99.9%殺菌效率）。7天后對照組小鼠全部死亡，按10mg/kg?Plectasin給藥的小鼠存活率依給藥頻度不同介于80-100%。NZ2114在兔心內膜炎感染模型中的治療效果也得到相似結論，10mg/kg?NZ2114即可大于或等于15mg/kg萬古霉素或12mg/kg達托霉素療效，3天后相關臟器（腎臟，脾臟）中病原菌的數量減少99%以上(Xiong等，Efficacy?of?NZ2114,a?novel?plectasin-derived?cationic?antimicrobial?peptide?antibiotic,in?experimental?endocarditis?due?to?methicillin-resistant?Staphylococcus?aureus.Antimicrobial?Agents?and?Chemotherapy,2011,55(11):5325-5330)。?