[發明專利]應用鵝胚傳代細胞系和生物反應器培養小鵝瘟病毒的方法

有效

• 申請號: 201310243434.X
• 申請日: 2013-06-19
• 公開（公告）號: CN103320393A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 李陽;閆艷麗;劉雪;徐曉艷;王二先
• 申請（專利權）人: 浙江美保龍生物技術有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及應用鵝胚傳代細胞系和生物反應器培養小鵝瘟病毒的方法。

背景技術

小鵝瘟（Gosling?Plague，GP）是由小鵝瘟病毒（Gosling?Plague?Virus，GPV）引起的雛鵝急性或者亞急性的敗血性傳染病。本病主要侵害出殼后30日齡以內的雛鵝及雛番鴨，具有傳播快，發病率和死亡率高的特點，死亡率可達90%~100%。1956年，方定一首先在我國揚州發現本病，并于1961年用鵝胚分離到該病毒。1965年后，在匈牙利、德國、荷蘭、前蘇聯、意大利、英國、法國、南斯拉夫、越南、以色列等國家先后報道了該病的存在。目前世界許多飼養鵝及番鴨地區都有本病的爆發和流行。GPV是細小病毒科（Parvoviridae），細小病毒屬（Parvovirinae）中的細小病毒（Parvovirus）成員，為無囊膜，單鏈DNA病毒，直徑為20~22nm，是目前已知的動物病毒中較小、較簡單病毒之一。鵝細小病毒以腸道栓塞為特征性病變，該病發病急，死亡率高，是危害養鵝業的主要傳染病之一。病鵝表現為精神萎頓、昏睡、食欲廢絕、排出灰白色或者淡黃色稀糞便、混有氣泡、肛門外突，周圍被毛潮濕并有污染物。臨死前出現兩腿麻痹或者抽搐癥狀。目前小鵝瘟無有效治療藥物，最有效的辦法是對健康鵝實施疫苗接種加以預防。

目前繁殖培養小鵝瘟病毒的方法基本上為鵝胚培養法、鴨胚培養法以及轉瓶鵝胚原代成纖維細胞培養法。直接采用胚體進行病毒繁殖易受非免疫胚體來源限制，同時采用胚體繁殖病毒，由于培養的病毒懸液中含有大量雜蛋白會給后續疫苗制備帶來安全隱患，另外胚體廢棄物處理不當也會存在散毒的危險。轉瓶原代細胞培養技術雖然比較成熟，但是制備原代成纖維細胞工序繁瑣，并且批次間差異較大，培養的病毒量小毒價低，同時也存在胚體源外源病毒污染的生物安全隱患。

近年來，生物反應器和微載體技術培養細胞、繁殖病毒在生物制藥行業應用廣泛。與傳統的胚體和轉瓶培養工藝相比，懸浮培養技術有著巨大的優勢：首先單位體積內有效工作細胞數量增加；其次全密閉、管道化系統生產流程及過程自動化監控、控制技術，不僅減少了污染細胞的機會，而且在減輕勞動強度的同時減少人為操作因素影響；再者生物反應器容積的擴大，提高了產品的均一性，也提高了產品的產量和質量；最后生產疫苗所用的成本遠低于傳統胚體培養工藝與轉瓶培養工藝，綜合成本大大降低。我國的生物反應器懸浮培養技術起步較晚，但近幾年該技術在國內的發展非常快。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種應用鵝胚傳代細胞系和生物反應器培養小鵝瘟病毒的方法的技術方案，該方法可以縮短生產周期，降低人員配置，污染幾率低，占地面積小，并且得到的病毒滴度高，批間差異小。

所述的應用鵝胚傳代細胞系和生物反應器培養小鵝瘟病毒的方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

1）種細胞的培養：用細胞生長液對種細胞進行培養；

2）繁殖病毒用細胞的懸浮培養：將步驟1）培養得到的種細胞懸浮液接種至灌注袋中，吸附后在生物反應器中加入細胞生長液進行懸浮培養；

3）病毒的培養與收獲：將小鵝瘟病毒懸液接種于生物反應器中，換用維持液進行培養，接毒后實時監測糖耗情況，當糖耗接近0時，即開始收獲病毒，收獲病毒后，反復凍融灌注袋，收獲全懸病毒液，經檢驗合格后置于-20℃保存。

所述的應用鵝胚傳代細胞系和生物反應器培養小鵝瘟病毒的方法，其特征在于所述的步驟1）中種細胞為鵝胚傳代細胞系CGBQ。

所述的應用鵝胚傳代細胞系和生物反應器培養小鵝瘟病毒的方法，其特征在于所述的步驟1）中種細胞采用方瓶培養法、轉瓶培養法或微型反應器培養法進行培養。

所述的應用鵝胚傳代細胞系和生物反應器培養小鵝瘟病毒的方法，其特征在于所述的步驟2）中生物反應器為激流灌注式生物反應器、攪拌式生物反應器或潮汐式生物反應器。

所述的應用鵝胚傳代細胞系和生物反應器培養小鵝瘟病毒的方法，其特征在于所述的步驟2）中生物反應器的微載體類型為聚酯纖維紙片，使用前用滅菌PBS浸泡過夜。

所述的應用鵝胚傳代細胞系和生物反應器培養小鵝瘟病毒的方法，其特征在于所述的步驟2）中懸浮培養條件為：溫度37～38℃，pH7.0～7.6，溶解氧30%～60%，接種量為3～6×10⁹個細胞。

所述的應用鵝胚傳代細胞系和生物反應器培養小鵝瘟病毒的方法，其特征在于所述的步驟2）中懸浮培養時根據細胞糖耗情況隨時補糖或者補加細胞生長液，確保殘糖不低于2g/L。