[發明專利]α-半乳糖苷酶缺陷的治療

有效

• 申請號: 201310243356.3
• 申請日: 2000-03-09
• 公開（公告）號: CN103585621A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: R·F·賽爾頓;M·布羅斯克;C·M·克諾施塔;D·A·瑞寇;M·D·維拉姆斯;T·J·舒特茲;P·F·達尼爾
• 申請（專利權）人: 夏爾人類遺傳性治療公司
• 主分類號: A61K38/47
• 分類號: A61K38/47;C12N9/40;A61P3/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 劉曉東

本申請是申請號為00807312.0、申請日為2000年3月9日、發明名稱為“α-半乳糖苷酶缺陷的治療”的中國發明專利申請的分案申請。

發明領域

本發明涉及用于治療α-半乳糖苷酶A缺陷的方法和組合物。

發明背景

Fabry病（費勃萊氏病，酰基鞘氨醇己三糖苷酶缺乏癥）是X染色體連鎖的遺傳性溶酶體貯積病，特征為嚴重的腎損傷、血管角質瘤、和心血管異常（包括心室膨大和二尖瓣閉鎖不全）。Fabry病還影響外周神經系統，引起極度痛苦的發作，四肢灼痛。Fabry病是由α-半乳糖苷酶A(α-Gal?A)的缺陷引起的。α-Gal?A是溶酶體糖水解酶，切割各種復合糖的末端α-半乳糖基部分。Fabry病導致阻斷中性糖神經鞘脂－－酰基鞘氨醇己三糖苷(CTH)的分解代謝，并在細胞內和血流中積累這種酶底物。

由于這種疾病具有X染色體連鎖的遺傳模式，大多數Fabry病患者是男性。雖然已經觀察到受到嚴重影響的女性雜合子，但是女性雜合子通常沒有癥狀，或者具有相對較弱的癥狀（諸如特征性角膜混濁）。剩余α-Gal?A活性低、抑或有很微弱的癥狀抑或表面上沒有Fabry病其它特征性癥狀的非典型性變異型Fabry病，與左心室肥大和心臟病有關Nakano等人，新英格蘭醫學雜志(New?Engl.J.Med.)333：288－293，（1995）。α-Gal?A的降低可能是這些心臟異常的病因。

已經分離得到了編碼人α-Gal?A的cDNA和基因并進行了測序。人α-Gal?A是作為429個氨基酸的多肽表達的，其N末端31個氨基酸為信號肽。人的這種酶已經在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中（Desnick等人，美國專利5,356,804；Ioannou等人，細胞生物學雜志(J.Cell?Biol.)119：1137，（1992））和昆蟲細胞中（Calhoun等人，WO?90/11353）得到表達。

然而，目前的α-Gal?A制劑的功效有限。高純度α-Gal?A的制備方法依賴于使用的親和層析法，即植物凝血素親和層析法（伴刀豆球蛋白A（ConA）和基于將α-Gal?A與基質偶聯的底物類似物N-6-氨基己酰基-α-D-半乳糖基胺的結合的親和層析法的聯合。參閱例如，Bishop等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)256：1307－1316，1981）。使用蛋白質性質的植物凝血素親和樹脂和底物類似物樹脂通常與親和劑從固相支持物連續脫落有關（Marikar等人，分析生化(Anal.Biochem.)201：306－310，1992），導致純化產物中污染了在溶液中游離的或結合了洗脫蛋白質的親和劑。這些污染使產物不適合用于制藥學制劑。結合的底物類似物和植物凝血素也可能對蛋白質的酶學、功能性、和結構特性具有實質性的消極影響。此外，用以前的方法制備的α-Gal?A在肝臟中被快速清除。

因此，本領域仍然需要使用傳統層析樹脂的純化方案，這種樹脂可以從供應商處容易地獲得，質量適用于大劑量商業用途，而且產生的α-Gal?A制劑，不含親和劑。另外，本領域仍然需要循環半衰期延長、在肝臟以外的特定組織中的攝取增加的α-Gal?A制劑。

發明概述

本發明提供了高純度的α-Gal?A制劑及用于純化α-Gal?A糖形式的多種方法。本發明還提供了電荷改變的α-Gal?A制劑及其制備方法。電荷變化是通過增加α-Gal?A的唾液酸含量和/或增加α-Gal?A的磷酸化來實現的。本發明還提供了在哺乳動物宿主中循環半衰期延長的α-Gal?A制劑及其制備方法。最后，本發明還提供了對受治療者施用α-Gal?A制劑的方法和劑量。本發明的α-Gal?A可用于治療Fabry病患者或Fabry病非典型性變異型患者（如主要為心血管異常的特定Fabry病患者群，諸如心室膨大，如左心室肥大（LVH），和/或二尖瓣閉鎖不全；或者主要為腎累及的患者）。

圖的簡述

圖1表示用于從人成纖維細胞cDNA文庫分離α-Gal?A?cDNA的210bp探針（SEQ?ID?NO：1）。探針的序列來自α-Gal?A基因的外顯子7。該探針是通過聚合酶鏈反應（PCR）由人基因組DNA分離的。圖中標有下劃線的區域對應于擴增引物的序列。

圖2表示完成α-Gal?A?cDNA克隆5’端的DNA片段的序列（SEQ?ID?NO：2）。此片段是通過PCR由人基因組DNA擴增的。標有下劃線的區域對應于擴增引物的序列。同時還標明了實施例1中所述亞克隆利用的NcoI和SacII限制性內切酶位點的位置。