[發明專利]一種簡便的植物BY-2細胞冷凍保存方法有效
| 申請號： | 201310243031.5 | 申請日： | 2013-06-08 |
| 公開（公告）號： | CN103283716A | 公開（公告）日： | 2013-09-11 |
| 發明（設計）人： | 賀彬 | 申請（專利權）人： | 賀彬 |
| 主分類號： | A01N1/02 | 分類號： | A01N1/02 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 454000 河南省焦*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 簡便 植物 by 細胞 冷凍 保存 方法 | ||
1.一種簡便的植物BY-2細胞冷凍保存方法，其特征在于，它包括如下步驟：
A.預培養：將煙草葉片的愈傷組織在含8％的蔗糖液體培養基中預培養5天；
B.冷凍保護劑的預處理：將預培養后的細胞懸浮液4℃800rpm離心5min，吸去上清液后保留2ml細胞液轉移至冷凍保藏管中，然后在保留的細胞液中加入冷凍保護劑，密封；
C.加入冷凍保護劑：冷凍保護劑包括50％山梨醇0.572ml、二甲基亞砜0.286ml、細胞懸浮液2ml，其中，山梨醇經過高壓蒸汽滅菌，二甲基亞砜經過紫外燈滅菌；冷凍保護劑的體積可按上述比例擴大和縮??；
D.降溫冷凍程序：采用分步冷凍法：將預處理后的材料降溫至4℃下靜置預處理30min，再在-20℃，停留30min，再-40℃，靜置3h，最后將處于冷凍保藏管中的細胞放置-80℃中保存；
E.冷凍保藏后的細胞復蘇的培養步驟：
(1)取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉；
(2)將新鮮培養液置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70％酒精并擦拭盛裝培養液的容器，移入無菌操作臺內；
(3)取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1min內全部融化，以70％酒精擦拭保藏管外部，移入無菌操作臺內；
(4)取出解凍的細胞懸浮液，緩緩加入有培養基的培養容器內，稀釋比例為1∶10，混合均勻，放入培養箱培養；
(5)在解凍培養后隔日更換培養液。
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