[發(fā)明專利]一種簡(jiǎn)便的植物BY-2細(xì)胞冷凍保存方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310243031.5
• 申請(qǐng)日: 2013-06-08
• 公開（公告）號(hào): CN103283716A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賀彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 賀彬
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物細(xì)胞冷凍保存復(fù)蘇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種模式植物煙草的愈傷組織的超低溫冷凍保存方法。

背景技術(shù)

煙草(tobacco)是茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana?tabacum)一年生草本植物，大約有60多種。煙草的特點(diǎn)是易于進(jìn)行組織培養(yǎng)、容易得到轉(zhuǎn)化植株而成為典型的模式植物，與擬南芥同被譽(yù)為植物界的“果蠅”，在技術(shù)應(yīng)用中，其可作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)抗癌的基因產(chǎn)物，然后利用生物技術(shù)予以提取，用于醫(yī)學(xué)治療。另外，煙草在開發(fā)食品和藥物資源方面的諸多潛在用途將會(huì)不斷地被發(fā)現(xiàn)、利用。因此，通過組織培養(yǎng)得到煙草細(xì)胞具有重要醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值。其種質(zhì)資源的保存和保護(hù)是科研人員所面臨的一個(gè)重要難題。這是因?yàn)榧?xì)胞的傳代是有限制的，長(zhǎng)期連續(xù)傳代的細(xì)胞不僅消耗大量的人力和物力，而且細(xì)胞的生長(zhǎng)于形態(tài)等會(huì)有一定退變或轉(zhuǎn)化，因而細(xì)胞失去原有的遺傳特性，有時(shí)還會(huì)由于細(xì)胞污染而造成傳代中斷，種質(zhì)丟失。因此，在實(shí)際工作中常需要凍存一定數(shù)量的細(xì)胞，以備替換備用。關(guān)于煙草愈傷組織的冷凍保存方法尚未見報(bào)道，因此找到一種簡(jiǎn)單易行且高效率的冷凍保存方法顯得十分重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種煙草愈傷組織的冷凍保存方法，通過對(duì)凍存過程中影響細(xì)胞存活率的因素的分析和提高資源利用率等方面考慮，實(shí)驗(yàn)得出了一套超低溫保存煙草愈傷組織的方法，該方法簡(jiǎn)單易行，凍存后的細(xì)胞有較高的存活率，豐富了超低溫保存的方法，對(duì)其他植物種類的愈傷組織的超低溫保存也提供了一定的參考。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

首先對(duì)取得的煙草葉片愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)使其獲得良好的生長(zhǎng)狀況，然后在冷凍保護(hù)劑存在下，將煙草愈傷組織細(xì)胞液在4℃，-20℃，-40℃依次處理，最后于-80℃保存?zhèn)溆茫〕鰰r(shí)采用快速融化法37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1min內(nèi)全部融化冷凍細(xì)胞液，離心去上清液后換入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)即可使用。

具體步驟如下：

預(yù)培養(yǎng)：將煙草葉片的愈傷組織在含8％的蔗糖液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)5d；

冷凍保護(hù)劑的預(yù)處理：將預(yù)培養(yǎng)后的細(xì)胞懸浮液4℃800rpm離心5min，吸去上清液后保留2ml細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至冷凍保藏管中，然后在保留的細(xì)胞液中加入冷凍保護(hù)劑，密封；

加入冷凍保護(hù)劑的方式：50％山梨醇0.572ml、二甲基亞砜0.286ml、細(xì)胞懸浮液2ml，其中，山梨醇經(jīng)過高壓蒸汽滅菌，二甲基亞砜經(jīng)過紫外燈滅菌；

降溫冷凍程序：采用分步冷凍法：將預(yù)處理后的材料降溫至4℃下靜置預(yù)處理30min，再在-20℃，停留30min，再-40℃，靜置3h，最后將處于冷凍保藏管中的細(xì)胞放置-80℃中保存；

冷凍保藏后的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)步驟：

(1)取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時(shí)蓋子易松掉；

(2)將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70％酒精并擦拭容器以滅菌，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)；

(3)取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1min內(nèi)全部融化，以70％酒精擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)；

(4)取出解凍的細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器內(nèi)，稀釋比例為1∶10，混合均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

(5)在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

本發(fā)明所用的二甲基亞砜(DMSO)是一種滲透性保護(hù)劑，能夠降低細(xì)胞冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，減少自由基對(duì)細(xì)胞損害，改變生物膜對(duì)電解質(zhì)、藥物、毒物和代謝產(chǎn)物的通透性。細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的水分會(huì)很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)。細(xì)胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。保護(hù)劑一般使用甘油或二甲基亞砜，該物質(zhì)分子量小，溶解度大，容易穿透細(xì)胞，其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而使冰點(diǎn)下降和保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮，且對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。目前DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對(duì)細(xì)胞的毒性作用較大，而在4℃時(shí)，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。