[發明專利]表達豬圓環病毒Ⅱ型ORF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株及其制備方法

有效

• 申請號: 201310242909.3
• 申請日: 2013-06-19
• 公開（公告）號: CN103509761A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 陳紅英;崔保安;鈔安軍;鄭蘭蘭;朱前磊;魏戰勇;李新生;李坤
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/34;C12N15/63;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 范之敏

技術領域

本發明涉及一種表達豬圓環病毒Ⅱ型ORF2基因重組豬偽狂犬病毒PGO株的制備方法。

背景技術

豬圓環病毒(Porcine?circovirus,?PCV)屬于圓環病毒科圓環病毒屬，是目前為止發現的最小的脊椎動物病毒。PCV根據致病性、抗原性及核苷酸序列的不同分為PCV1和PCV2兩種基因型。其中PCV1廣泛存在于豬群但對其無致病性，基因組長度為1759bp。PCV2具有致病性，基因長度為1767bp或者1768bp，PCV2不僅是世界各國普遍存在的仔豬斷奶后多系統衰竭征(PMWS)的致病病原，而且與豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、母豬流產、豬繁殖障礙、肥豬炎性呼吸道病綜合征(PRDC)及死亡綜合征（SAMA）的發生具有重要關系。另外PCV2能夠侵害淋巴系統從而引起豬體免疫抑制，繼發感染豬流感、豬偽狂犬、豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟等病毒性傳染病及多種細菌性傳染病，從而使疫情變得更加嚴重，現階段該病毒的廣泛存在已給我國及全球其他國家的養豬業造成了嚴重的經濟損失。目前國內外能有效防制本病的疫苗較少，因此，PCV2安全有效疫苗的研究對PCV2相關性疾病控制及根除具有重要意義。

PRV為皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，基因組DNA龐大，為150?kbp，具有分子量大、宿主范圍廣、易于建立潛伏感染、可插入基因多等特性，具有以下優點：①病毒遺傳背景清楚。②安全性好，現有的活疫苗株HB98及Bartha-K61等疫苗已應用多年且安全有效。⑤生產方法簡單，成本較低，接種相對方便。③免疫期較長：PRV作為活病毒載體接種機體后主要以細胞免疫為主，故外源基因能夠在體內進行持續表達。④宿主范圍較廣，豬、山羊、牛、綿羊、狗、貓、等多種動物均能感染PRV，故能夠針對不同動物的研制不同的活載體疫苗以便控制該病的流行。⑥PRV對人無感染性，這些優點決定了PRV可以成為優良的活病毒載體。

發明內容

本發明的目的是提供一種重組豬偽狂犬病毒毒株，分類命名：重組豬偽狂犬病毒，拉丁文學名：Herpesviridae。保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏單位簡稱：CCTCC，保藏單位地址：湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學，保藏日期：2013年5月28日,?保藏編號CCTCC?NO：V201315。

本發明的技術方案是：一種表達豬圓環病毒Ⅱ型ORF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株，重組豬偽狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCC?NO：V201315。

所述的表達豬圓環病毒Ⅱ型ORF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株的制備方法，包括設計與合成引物，增殖偽狂犬病毒，提取偽狂犬病毒DNA，轉染，純化，所述轉染步驟如下：

（1）取100?μLTCID50為10^-6.125/0.1ml的PRV?TK^-/gG^-/gE^-病毒接種到六孔板中并用DMEM培養液補至350μL，置細胞培養箱中吸附2h，每隔30min搖晃一次；

（2）將240?μl無血清培養基OPTI-MEM和10?μl??Lipofectamine?2000于EP管中混合均勻，得到溶液A；

（3）將4?μg去內毒素質粒PGO補OPTI-MEM至總體積250?μL并于EP管中混合均勻，孵育5min，得到溶液B；

（4）將溶液A和溶液B混合后在室溫下靜置20-30min，得到溶液C；

（5）將步驟（1）中六孔板中的細胞用無血清培養基沖洗兩遍后，加入2?ml無血清培養基；

（6）將步驟（4）中溶液C逐滴加入六孔板中，搖動培養板，輕輕混勻，在37℃，體積濃度為5%的CO₂中保溫5-6h；

（7）6h后，更換有血清的全培養基，37℃，5%CO₂中48-72h檢測轉染水平。