[發明專利]表達豬圓環病毒Ⅱ型ORF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株及其制備方法有效
| 申請號： | 201310242909.3 | 申請日： | 2013-06-19 |
| 公開（公告）號： | CN103509761A | 公開（公告）日： | 2014-01-15 |
| 發明（設計）人： | 陳紅英;崔保安;鈔安軍;鄭蘭蘭;朱前磊;魏戰勇;李新生;李坤 | 申請（專利權）人： | 河南農業大學 |
| 主分類號： | C12N7/01 | 分類號： | C12N7/01;C12N15/34;C12N15/63;C12R1/93 |
| 代理公司： | 鄭州中原專利事務所有限公司 41109 | 代理人： | 范之敏 |
| 地址： | 450002*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 表達 圓環 病毒 orf2 基因 重組 狂犬病毒 及其 制備 方法 | ||
【權利要求書】：
1.一種表達豬圓環病毒Ⅱ型ORF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株，其特征在于：重組豬偽狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCC?NO：V201315。
2.如權利要求1所述的表達豬圓環病毒Ⅱ型ORF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株的制備方法，包括設計與合成引物，增殖偽狂犬病毒，提取偽狂犬病毒DNA，轉染，純化，其特征在于：所述轉染步驟如下：
（1）取100?μL?TCID50為10-6.125/0.1ml的PRV?TK-/gG-/gE-病毒接種到六孔板中并用DMEM培養液補至350μL，置細胞培養箱中吸附2h，每隔30min搖晃一次；
（2）將240?μl無血清培養基OPTI-MEM和10?μl??Lipofectamine?2000于EP管中混合均勻，得到溶液A；
（3）將4?μg去內毒素質粒PGO補OPTI-MEM至總體積250?μL并于EP管中混合均勻，孵育5min，得到溶液B；
（4）將溶液A和溶液B混合后在室溫下靜置20-30min，得到溶液C；
（5）將步驟（1）中六孔板中的細胞用無血清培養基沖洗兩遍后，加入2?ml無血清培養基；
（6）將步驟（4）中溶液C逐滴加入六孔板中，搖動培養板，輕輕混勻，在37℃，體積濃度為5%的CO2中保溫5-6h；
（7）6h后，更換有血清的全培養基，37℃，5%CO2中48-72h檢測轉染水平。
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