[發明專利]鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養方法

在審

• 申請號: 201310241689.2
• 申請日: 2013-06-18
• 公開（公告）號: CN104232562A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 李晨光;王擁軍;趙永見;施杞;楊燕萍;牛凱
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學附屬龍華醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 潘詩孟

技術領域

本發明涉及一種鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養方法，該方法適用于椎間盤組織工程學，椎間盤移植術以及藥物防治椎間盤退變等多方面的研究。

背景技術

脊柱退變性疾病的病理基礎是椎間盤退變。它包括了頸椎病和腰椎間盤突出等疾病，發病率逐年升高并嚴重危害中老年人的身體健康。通過退變產生的脊柱失穩、椎管狹窄刺激或壓迫肌肉、神經根、血管和脊髓，甚至通過脊神經反射影響內臟功能。目前臨床治療手段大部患者采用保守的對癥治療以拖延病情發作，少數患者手術治療摘除病變的椎間盤。開發針對病理環節的藥物需要有以椎間盤為對象的實驗平臺支撐，由于缺少椎間盤細胞株，而傳統二維平面培養的原代椎間盤細胞，難以保持其該有的生物學特性。

發明內容

針對傳統二維平面培養的上述不足，根據實施例，希望提出較好的保持了椎間盤的生物學特性，可操作性強，成功率高的鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養方法，在椎間盤移植術以及藥物防治椎間盤退變的治療及研究方面具有廣闊的前景。

根據實施例，本發明提供的一種鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養方法，包括如下步驟：

用磷酸鹽緩沖液(縮寫PBS，pH值7.2～7.4：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L)緩沖液配制濃度為2wt%的瓊脂糖凝膠，與含10wt%胎牛血清（Fetal?Calf?Serum，縮寫FBS，Biowest公司訂購）的細胞培養基（Dulbecco's?Modified?Eagle?Medium，縮寫DMEM，Biowest公司訂購）培養液按體積比1：1混合形成三維培養膠；

將從活體C57品系小鼠上剪切下來的鼠尾立即消毒并剝皮后投入PBS中清洗；在體視學顯微鏡下，剝除椎旁韌帶顯露椎間盤，沿上下軟骨終板完整的切下椎間盤，用PBS清洗；將前述三維培養膠鋪平培養皿，將椎間盤快速種植入三維培養膠內，待凝固后再加入含10wt%FBS的DMEM培養液覆蓋表面，放入培養箱內，每天更換含10wt%FBS的DMEM培養液一次。

根據一個實施例，本發明前述鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養方法中，進一步包括如下步驟：從培養箱內取出培養皿，在37℃恒溫水平搖床內以60rpm頻率搖晃，每次60分鐘，每日早晚各一次，連續刺激兩天。

隨后的實施例將證明，本發明方法成功的實現了鼠尾椎間盤的體外培養，克服了傳統二維平面培養的缺點，較好的保持了椎間盤的生物學特性，本發明可操作性強，成功率高。隨后的實施例通過多種技術方法：顯微鏡下連續觀察、模擬力學刺激、特殊病理切片染色、PCR定量分析力生長因子和膠原和蛋白等基因表達，最終證實了本發明方法成功的在體外連續培養鼠尾椎間盤達12天。本發明方法適用于椎間盤組織工程學，椎間盤移植術以及藥物防治椎間盤退變等多方面的治療及研究。

附圖說明

圖1為本發明鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養的顯微解剖圖。

圖2為本發明鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養的椎間盤種植圖。

圖3為本發明鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養的連續觀察圖。

圖4為本發明鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養的病理切片藏紅固綠染色圖。

圖5a為本發明鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養的MGF原位雜交圖（椎間盤和纖維環部分）。

圖5b為本發明鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養的MGF原位雜交圖（髓核和軟骨終板部分）。

圖6是IGF基因選擇性剪接示意圖（據此設計PCR引物和原位雜交的位點）。

具體實施方式

本發明方法利用三維膠體外立體培養椎間盤細胞，以維持其生物學特性，方便實驗研究的目標。下面結合附圖和具體實例，進一步闡述本發明鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養技術。這些實例應理解為僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。在閱讀了本實用鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養技術記載的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本實用鼠尾椎間盤體外三維膠立體培養技術權利要求所限定的范圍。

1、椎間盤體外培養三維膠的配制

PBS配制2wt%瓊脂糖，高溫高壓滅菌，趁熱分裝于50ml離心管，每管10ml室溫下冷卻凝固，常溫保存。使用時在微波爐中火加熱1min融化后，溫水中與10wt%FBS的DMEM培養液按體積比1：1溶合成三維培養膠待用。

2、鼠尾椎間盤的顯微手術完整分離步驟