[發明專利]一種人皮膚干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法

有效

• 申請號: 201310239565.0
• 申請日: 2013-06-18
• 公開（公告）號: CN103275928A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 陳春雷;馬華剛;程順峰;孫理蘭;沈偉
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/075
• 代理公司: 青島高曉專利事務所 37104
• 代理人: 隋臻瑋

技術領域：

本發明涉及一種人皮膚干細胞（human?Skin?Stem?Cell簡稱hSSC）體外向原始生殖細胞樣細胞（Primordial?germ?cell-like?cells簡稱PLCs）分化的技術方法，屬于生殖醫學的生物醫學技術領域。

背景技術：

從2003年開始，多個實驗組報導了他們將哺乳類干細胞，包括人類干細胞，誘導為各發育階段的生殖細胞。在以雄性配子為目標的報導中，2003年Toyooka等首先以Vasa基因為PGC報告系統(reporter?system)，及BMP4為誘導因子，將小鼠干細胞誘導為PGCs（原始生殖細胞primordial?germ?cells）；并接著將分離出來的PGCs與睪丸細胞混合后移植到睪丸中產生精子。2004年，Geijsen等利用SSEA1為早期生殖細胞表面標記，加上RA(retinoic?acids)誘導小鼠干細胞，成功在體外獲得單倍體，并將其注射入小鼠卵子中，受精卵發育至囊胚期。德國研究小組Nayernia等同樣利用RA誘導小鼠干細胞，並以Stra8及Prm1為報告系統，獲得的類精細胞在注射入卵子后能獲得后代。此外，Nayernia等人也用小鼠骨髓干細胞在體外轉分化出了原始生殖細胞以及精原細胞樣的細胞。一直到2009年末，紀家葵等在高表達DAZL家族基因后，發現雄性人類胚胎干細胞能被誘導進入減數分裂，并形成單倍體。2011年日本Hayashi等利用小鼠胚胎干細胞體外培養獲得EpiLCs并加上BMP4、LIF、SCF等誘導因子，分離出PLCs，之后移植到睪丸，獲得成熟精子并生產了健康的小鼠后代。

綜合最近研究進展，大都采用胚胎干細胞（ESC）作為原材料，但是ESC處在哺乳動物個體發育的早期，而且取材困難，因此采用成體干細胞代替ESC向生殖細胞分化可以更好的解決這一問題。人皮膚干細胞是一類具有自我更新能力及多向分化潛能的多能成體干細胞。

發明內容：

本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種人皮膚干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法。

為了實現上述發明目的，本發明方法利用機械法分離人皮膚干細胞（hSSC），體外培養人皮膚干細胞，利用hSSC體外形成擬胚體（Embryoid?Body簡稱EB）的方法進行分化，分化后用BMP-4、SCF、EGF、bFGF等細胞因子體外誘導14天，可獲得一些能夠表達早期生殖細胞基因的PLCs，之后采用豬的卵泡液進行誘導。

本發明方法按照如下步驟操作：第一步，人皮膚的分離：將人的皮膚取下，轉移至磷酸鹽緩沖液（PBS）+10%胎牛血清（FBS）的操作液中，在操作液中洗3次，去掉與皮膚連接

在一起的血凝塊和脂肪；在新鮮DMEM/F12（Dulbecco's?Modified?Eagle?Medium，F-12Nutrient?Mixture）中將分離干凈的皮膚洗3次；

第二步，皮膚干細胞的體外培養：皮膚經DMEM/F12洗完后，用剪刀剪碎，再經DMEM/F12洗3遍；然后置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA（TE），37℃消化，輕輕吹打混勻后加入10%血清終止消化，DMEM/F12中洗3遍，最后用移液槍吹打，直至組織能夠自由進入槍頭，將吹打好的組織過篩到皮膚干細胞培養液培養；所述皮膚干細胞培養液包含：DMEM/F12、2%B-27、20ng/ml表皮生長因子（EGF）、40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、1%青鏈霉素，以培養當天為零代，每4天傳代一次；

第三步，皮膚干細胞體外形成擬胚體（EB）：當皮膚干細胞培養到第二代3-4天時（即培養的11-12天），離心收集細胞，棄上清，加入0.25%Trypsin室溫消化，然后輕輕吹打至單細胞，終止消化，M199（Medium199）洗兩遍后轉入SARSTEDT懸浮培養24孔板，置于EB培養基中培養，EB培養液包括：M199（Medium199）(pH7.0)、3mg/ml牛血清蛋白（BSA）、1mg/ml胎球蛋白、5ul/ml胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉(ITS)、0.23mM丙酮酸鈉、1ng/ml表皮生長因子（EGF）、20ng/ml激活素A（Activin?A）和30ng/ml的骨形態發生蛋白-4（BMP-4）；