[發明專利]一種人皮膚干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法

有效

• 申請號: 201310239565.0
• 申請日: 2013-06-18
• 公開（公告）號: CN103275928A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 陳春雷;馬華剛;程順峰;孫理蘭;沈偉
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/075
• 代理公司: 青島高曉專利事務所 37104
• 代理人: 隋臻瑋

1.一種人皮膚干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法，其特征在于：按照如下步驟操作：第一步，人皮膚的分離：將人的皮膚取下，轉移至磷酸鹽緩沖液+10%胎牛血清的操作液中，在操作液中洗3次，去掉與皮膚連接在一起的血凝塊和脂肪；在新鮮DMEM/F12中將分離干凈的皮膚洗3次；第二步，皮膚干細胞的體外培養：皮膚經DMEM/F12洗完后，用剪刀剪碎，再經DMEM/F12洗3遍；然后置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA，37℃消化，輕輕吹打混勻后加入10%血清終止消化，DMEM/F12中洗3遍，最后用移液槍吹打，直至組織能夠自由進入槍頭，將吹打好的組織過篩到皮膚干細胞培養液培養；所述皮膚干細胞培養液包含：DMEM/F12、2%B-27、20ng/ml表皮生長因子、40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、1%青鏈霉素，以培養當天為零代，每4天傳代一次；第三步，皮膚干細胞體外形成擬胚體：當皮膚干細胞培養到第二代3-4天時，離心收集細胞，棄上清，加入0.25%Trypsin室溫消化，然后輕輕吹打至單細胞，終止消化，Medium199洗兩遍后轉入SARSTEDT懸浮培養24孔板，置于擬胚體培養基中培養，擬胚體培養液包括：pH7.0的Medium199、3mg/ml牛血清蛋白、1mg/ml胎球蛋白、5ul/ml胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉、0.23mM丙酮酸鈉、1ng/ml表皮生長因子、20ng/ml激活素A和30ng/ml的骨形態發生蛋白-4；第四步，擬胚體培養3-4天后開始向原始生殖細胞分化：用0.25%Trypsin消化擬胚體，室溫消化過程中用移液槍吹打至單細胞，用血清終止消化，收集細胞，離心；棄上清，加入培養液懸浮細胞；之后接種到24孔板中，每個孔接種細胞密度為5×10⁴；將培養板置于37℃、飽和濕度、5%CO₂中培養14天，培養液包括：DMEM高糖、10%胎牛血清、0.23mM丙酮酸鈉、0.1mM非必需氨基酸、2mM?L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巰基乙醇、20ng/ml表皮生長因子、40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、40ng/ml干細胞生長因子、1uM視磺酸和30ng/ml骨形態發生蛋白-4；第五步，豬卵泡液繼續培養：將24孔板的細胞消化下來，接種到用多聚賴氨酸處理過的培養皿里，每個培養皿的接種密度為1×10⁴，換成豬卵泡培養液進行培養；豬卵泡培養液包括：DMEM高糖、5%豬卵泡液、5%胎牛血清、0.23mM丙酮酸鈉、0.1mM非必需氨基酸、2mM?L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巰基乙醇。

2.根據權利要求1所述的一種人皮膚干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法，其特征在于：細胞熒光分析體外誘導得到的原始生殖細胞樣細胞表達Stra8和Dazl，達到早期減數分裂。