[發明專利]左氧氟沙星誘導志賀菌耐藥基因突變時序模型的建立

無效

• 申請號: 201310239279.4
• 申請日: 2013-06-18
• 公開（公告）號: CN103756993A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 段廣才;王穎芳;楊海燕;宋春花;馬楠;張衛東
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N1/20;C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 霍彥偉;王曉麗

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及體外構建喹諾酮耐藥志賀菌模型的方法，具體涉及喹諾酮類誘導多組志賀菌耐藥模型建立的方法。?

背景技術

細菌耐藥性的出現和蔓延在很大程度上是對抗感染治療的挑戰，以志賀菌為例，眾多研究已表明志賀菌目前頻繁出現耐藥株，且呈耐藥產生速度快、耐藥范圍廣、耐藥率高、各菌型耐藥譜不同等特點，喹諾酮作為目前治療菌痢的首選藥物，上世紀80年代投入使用時志賀菌屬細菌對其敏感性高達95%以上，菌痢的療效曾一度改觀。但近40年來，喹諾酮類抗生素應用廣泛，且該藥與其他抗菌藥物一起也用于動物感染的治療，細菌尤其是腸桿科細菌對喹諾酮類藥物呈現較高的耐藥性。?

靶基因突變是志賀菌屬細菌對喹諾酮類藥物的重要分子基礎，由染色體介導耐藥株靶基因突變存在多態性，誘導株多重耐藥性的產生可能是由于激活了它包括AcrAB在內的主動外排系統，主動外排機制和靶基因突變共同存在導致志賀菌屬細菌耐哇諾酮類藥物，?

雖然有研究用喹諾酮類藥物誘導志賀菌，但只是誘導一株志賀菌，形成單個誘導體系，所呈現的耐喹諾酮藥物靶基因gyrA、parC的突變先后順序不能排除自身隨機突變的影響，且不能從一致性和統計學概率上來解釋突變時序的準確性，不能說明問題。

發明內容

本發明的目的是克服以上不足，提供一種左氧氟沙星誘導志賀菌耐藥基因突變時序模型的建立。?

一種左氧氟沙星誘導志賀菌耐藥基因突變時序模型的建立，主要方法步驟如下：??

（1）????用紙片瓊脂擴散法對志賀菌進行頭孢唑啉、頭孢噻肟、氨芐西林、慶大霉素、氯霉素、四環素、復方新諾明、萘啶酸、吡哌酸、環丙沙星、諾氟沙星及左氧氟沙星12?種抗生素的藥敏試驗，以對12種抗菌藥物均敏感的為敏感株，判斷細菌敏感、中度敏感或耐藥，將敏感株于細菌固體培養基平板上劃線培養，選取生長良好的單菌落做誘導實驗；

（2）????用瓊脂稀釋法測定左氧氟沙星（Levofloxacin,?LEV）對誘導株原代的最低抑菌濃度MIC₀，?LEV?敏感、中介、耐藥標準依次為MIC（μg/ml）≤2、2~8、≥8；

（3）????從實驗誘導株的細菌固體培養基平板上挑取生長良好的單菌落至至少五管左氧氟沙星濃度為1/4×MIC₀的細菌液體培養基中，32℃-39℃震蕩培養細菌生長至對數期OD600=0.6-1；

（4）????取步驟（3）中一定量菌液至至少五管左氧氟沙星含量為1/4×?MIC₀的細菌液體培養基中再傳一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星濃度為1/2×?MIC₀的液體培養基中傳兩代，在藥物濃度達到敏感與中介臨界值前，依次將左氧氟沙星濃度倍增培養細菌，當藥物濃度達到敏感與耐藥臨界值后依次將左氧氟沙星濃度遞增培養，每次遞增1μg/ml；

（5）????當誘導抗菌藥物濃度達到2、4、8μg/ml時，菌株在該濃度中誘導培養兩天后，暫不誘導傳代，先做至少兩次無誘導劑傳代培養后，再接種于含相同濃度誘導劑的細菌固體培養基平板上過夜培養，挑選生長良好的單菌落繼續誘導培養，最終得到至少五組志賀菌誘導耐藥譜型；對該誘導耐藥譜型的菌株進行基因突變分析；

（6）????在誘導傳代的過程中，采用瓊脂稀釋法測定左氧氟沙星對實驗誘導株各代的MIC，?LEV?敏感、中介、耐藥標準依次為MIC（μg/ml）≤2、2~8、≥8；

（7）????構建左氧氟沙星誘導多組志賀菌耐藥基因突變模型，以此進行誘導耐藥基因突變時序分析。

上述左氧氟沙星誘導志賀菌耐藥基因突變時序模型的建立，所述的細菌固體培養基為LB固體培養基，所述的細菌液體培養基為LB液體培養基。?

上述左氧氟沙星誘導志賀菌耐藥基因突變時序模型的建立，步驟（3）中震蕩培養溫度為37℃。?

上述左氧氟沙星誘導志賀菌耐藥基因突變時序模型的建立，步驟（3）中震蕩培養細菌生長至OD600=0.9。?

上述左氧氟沙星誘導志賀菌耐藥基因突變時序模型的建立，步驟（4）中取步驟（3）中一定量菌液至N管左氧氟沙星含量為1/4×?MIC₀的LB液體培養基中，使終濃度為5×10⁵CFU/ml。?

上述左氧氟沙星誘導志賀菌耐藥基因突變時序模型的建立，最終7組志賀菌誘導傳代61代。?