[發(fā)明專利]左氧氟沙星誘導(dǎo)志賀菌耐藥基因突變時(shí)序模型的建立

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310239279.4
• 申請(qǐng)日: 2013-06-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103756993A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 段廣才;王穎芳;楊海燕;宋春花;馬楠;張衛(wèi)東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/01
• 分類號(hào): C12N15/01;C12N1/20;C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 鄭州中原專利事務(wù)所有限公司 41109
• 代理人: 霍彥偉;王曉麗

1.左氧氟沙星誘導(dǎo)志賀菌耐藥基因突變時(shí)序模型的建立，其特征在于，主要方法步驟如下：??

用紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)志賀菌進(jìn)行頭孢唑啉、頭孢噻肟、氨芐西林、慶大霉素、氯霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、萘啶酸、吡哌酸、環(huán)丙沙星、諾氟沙星及左氧氟沙星12?種抗生素的藥敏試驗(yàn)，以對(duì)12種抗菌藥物均敏感的為敏感株，判斷細(xì)菌敏感、中度敏感或耐藥，將敏感株于細(xì)菌固體培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，選取生長(zhǎng)良好的單菌落做誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)；

用瓊脂稀釋法測(cè)定左氧氟沙星對(duì)誘導(dǎo)株原代的最低抑菌濃度MIC₀，左氧氟沙星敏感、中介、耐藥標(biāo)準(zhǔn)依次為MIC（μg/ml）≤2、2~8、≥8；

從實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)株的細(xì)菌固體培養(yǎng)基平板上挑取生長(zhǎng)良好的單菌落至至少五管左氧氟沙星濃度為1/4×MIC₀的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，32℃~39℃震蕩培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期OD600=0.6~1；

取步驟（3）中一定量菌液至至少五管左氧氟沙星含量為1/4×?MIC₀的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中再傳一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星濃度為1/2×?MIC₀的液體培養(yǎng)基中傳兩代，在藥物濃度達(dá)到敏感與中介臨界值前，依次將左氧氟沙星濃度倍增培養(yǎng)細(xì)菌，當(dāng)藥物濃度達(dá)到敏感與耐藥臨界值后依次將左氧氟沙星濃度遞增培養(yǎng)，每次遞增1μg/ml；

當(dāng)誘導(dǎo)抗菌藥物濃度達(dá)到2、4、8μg/ml時(shí)，菌株在該濃度中誘導(dǎo)培養(yǎng)兩天后，暫不誘導(dǎo)傳代，先做至少兩次無(wú)誘導(dǎo)劑傳代培養(yǎng)后，再接種于含相同濃度誘導(dǎo)劑的細(xì)菌固體培養(yǎng)基平板上過(guò)夜培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)良好的單菌落繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，最終得到至少五組志賀菌誘導(dǎo)耐藥譜型，對(duì)該誘導(dǎo)耐藥譜型的菌株進(jìn)行基因突變分析；

在誘導(dǎo)傳代的過(guò)程中，采用瓊脂稀釋法測(cè)定左氧氟沙星對(duì)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)株各代的MIC，左氧氟沙星敏感、中介、耐藥標(biāo)準(zhǔn)依次為MIC（μg/ml）≤2、2~8、≥8；

構(gòu)建左氧氟沙星誘導(dǎo)多組志賀菌耐藥基因突變模型，以此進(jìn)行誘導(dǎo)耐藥基因突變時(shí)序分析。

2.如權(quán)利要求1所述的左氧氟沙星誘導(dǎo)志賀菌耐藥基因突變時(shí)序模型的建立，特征在于：所述的細(xì)菌固體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基，所述的細(xì)菌液體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基。

3.如權(quán)利要求1所述的左氧氟沙星誘導(dǎo)志賀菌耐藥基因突變時(shí)序模型的建立，特征在于：步驟（3）中震蕩培養(yǎng)溫度為37℃。

4.如權(quán)利要求1所述的左氧氟沙星誘導(dǎo)志賀菌耐藥基因突變時(shí)序模型的建立，特征在于：步驟（3）中震蕩培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)至OD600=0.9。

5.如權(quán)利要求1所述的左氧氟沙星誘導(dǎo)志賀菌耐藥基因突變時(shí)序模型的建立，特征在于：步驟（4）中取步驟（3）中一定量菌液至N管左氧氟沙星含量為1/4×?MIC₀的LB液體培養(yǎng)基中，使終濃度為5×10⁵CFU/ml。

6.如權(quán)利要求1所述的左氧氟沙星誘導(dǎo)志賀菌耐藥基因突變時(shí)序模型的建立，特征在于：最終7組志賀菌誘導(dǎo)傳代61代。

7.如權(quán)利要求1所述的左氧氟沙星誘導(dǎo)志賀菌耐藥基因突變時(shí)序模型的建立，其特征在于：通過(guò)多組基因突變的分析，尋找喹諾酮藥物靶基因突變時(shí)序的規(guī)律，利用這個(gè)模型確定在LEV誘導(dǎo)作用下喹諾酮藥物靶基因位點(diǎn)突變時(shí)序，推斷在人體或自然環(huán)境中志賀菌在外界LEV壓力下喹諾酮藥物靶基因位點(diǎn)突變時(shí)序，具體為：

（1）采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法對(duì)通過(guò)LEV篩選出的誘導(dǎo)株進(jìn)行檢測(cè)；

1）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增gyrA和parC基因：

①模板DNA制備：煮沸法提取模板DNA：取增菌6小時(shí)到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LB增菌肉湯1ml于1.5ml的Eppendorf管中，10000轉(zhuǎn)/分離心1分，棄上清，加三蒸水100?μl，在震蕩器上混勻煮沸10分鐘，稍離心，則上清液即為PCR模板DNA，將提好的DNA標(biāo)號(hào)后置?-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

②引物及引物設(shè)計(jì)：擴(kuò)增目的基因片段所需引物參考福氏2a志賀菌株301gyrA和parC基因公布序列，運(yùn)用Primer5軟件自行設(shè)計(jì)：

gyrA基因引物：gyrA基因全長(zhǎng)2628bp，?喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）在第166-410位點(diǎn)；gyrA基因上游引物A1位于gyrA基因第24-43位，下游引物A2位于gyrA基因第652-671位，PCR擴(kuò)增片段位于gyrA基因24-671位，產(chǎn)物648bp：

A1：5’-TAC?ACC?GGT?CAA?CAT?TAA?GG-3’，??

??A2：5’-TTA?ATG?ATT?GCC?GCC?GTC?GG-3’，

?parC基因引物：parC基因全長(zhǎng)2259bp，?QRDR區(qū)域在第175-411位點(diǎn)；parC基因上游引物C1位于parC基因第88-108位堿基，下游引物C2與parC基因第538-556位堿基互補(bǔ)，PCR擴(kuò)增片?段位于parC基因第88-556位點(diǎn)，產(chǎn)物469bp：

??C1：5’-GCG?TTG?CCG?TTT?ATT?GGT?GAT-3’，

??C2：5’-GCA?GGT?TAT?GCG?GTG?GAA?T-3’，?

③?PCR擴(kuò)增方案?

表1??gyrA和parC基因PCR擴(kuò)增體系（50μl）

混勻稍離心后，置溫度循環(huán)儀中，94℃預(yù)變性5min后，循環(huán)；94℃變性60s后，gyrA、parC分別在56℃和61℃退火45s，再于72℃延30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，?72℃延伸600s；循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測(cè)；

④?擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：制備1.5%瓊脂糖凝膠，取5μl?PCR產(chǎn)物與1μl溴酚蘭載樣緩沖液混合，加樣于瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，電壓5V/cm進(jìn)行電泳，電泳液為1×?TBE，停止電泳后，取膠在讀膠儀中觀察結(jié)果并照相，標(biāo)準(zhǔn)為100bp?DNA?Ladder；?

2)gyrA基因的限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

①限制性內(nèi)切酶消化：核酸片段越小，檢測(cè)的敏感性越高；對(duì)于大于400bp的PCR產(chǎn)物應(yīng)提前用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化處理；gyrA基因擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)有限制性內(nèi)切酶hinfⅠ的兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)（244thbp和343thbp），可將此段PCR產(chǎn)物消化成三條片段（221bp、99bp和328bp）：

酶切體系為50?μl

????PCR產(chǎn)物???????????????????????40?μl

????限制性內(nèi)切酶緩沖液??????????????4?μl???

????限制性內(nèi)切酶hinfⅠ??????????????6?μl?

混勻并稍離心，置放于37℃水浴中2h；

酶切反應(yīng)后，使用瓊脂糖凝膠水平電泳檢測(cè)酶切效果；?

②酶切圖譜分析：制備2%瓊脂糖凝膠，取7μl上述PCR產(chǎn)物與1μl載樣緩沖液混合，加樣點(diǎn)樣孔中，電壓5V/cm進(jìn)行電泳，電泳液為1×?TBE，并在讀膠儀上觀察酶切圖譜，照相，眾多研究表明，gyrA第244位堿基突變使HinfⅠ在該處識(shí)別位點(diǎn)喪失，從而只產(chǎn)生兩條酶切產(chǎn)物片段：320bp和328bp；

3)parC基因的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

①限制性內(nèi)切酶消化：對(duì)于大于400bp的PCR產(chǎn)物需要用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，產(chǎn)生較小的DNA片段，再進(jìn)行單鏈構(gòu)象分析；parC基因擴(kuò)增區(qū)域有限制性內(nèi)切酶hinfⅠ的識(shí)別位點(diǎn)279thbp，可將此段PCR產(chǎn)物消化成兩條片段191bp和278bp，消化方法同上；

②聚丙烯酰胺凝膠電泳：取3μl酶切樣品與22μl變性上樣液混合，進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，膠厚度1.0?mm，長(zhǎng)82mm，電壓8V/cm，恒壓電泳4h；分子量標(biāo)準(zhǔn)100bp?DNA?Ladder；

③銀染：電泳結(jié)束后，分開(kāi)兩塊玻璃板，將凝膠片放入100?ml銀染固定液中震蕩15min，三蒸水洗3次，每次2min，然后將凝膠片轉(zhuǎn)入100ml?0.2?%的AgNO₃液，用三蒸水洗3次，每次30s，加入100ml顯色液約7-10min，待DNA帶顯示清除時(shí)，吸去顯色液，加入固定液Na₂CO₃，靜置2-3min，取出凝膠觀察；置于看片燈上觀察結(jié)果并照相；

（2）采用基因測(cè)序的方法檢測(cè)突變的基因位點(diǎn)，尋找喹諾酮藥物靶基因gyrA、parC在LEV誘導(dǎo)下突變的時(shí)序規(guī)律；

1)核酸序列的測(cè)定：對(duì)實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)株志賀菌原代的gyrA、parC基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，另挑選部分誘導(dǎo)菌株，對(duì)gyrA、parC基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；委托北京六合華大基因科技公司進(jìn)行；

2)核酸序列的比對(duì)分析：在NCBI中通過(guò)BLST程序?qū)λ鶞y(cè)序列結(jié)果和從GenBank檢索到的gyrA、parC基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。