[發明專利]一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標記及其應用

無效

• 申請號: 201310238700.X
• 申請日: 2013-06-17
• 公開（公告）號: CN103436530A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 郭濤;羅文龍;陳志強;王慧;黃翠紅;劉永柱;張建國
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 謝敏楠

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地涉及一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標記及其應用。

背景技術

水稻是我國重要的農作物，香味是高品質稻米的一個重要特性，香型稻米的價格比非香型稻米的價格高，其育種工作得到了廣泛重視。選擇是香型稻米育種中最重要環節之一。傳統的香稻育種選擇方法，是通過表現型間接對香味基因型進行選擇，這種方法存在周期長、效率低、準確性較差等缺點。最有效的選擇，應是直接對香味基因型進行選擇，DNA分子標記的出現為這種直接選擇提供了可能。

絕大多數香稻品種的香味性狀主要受位于第8染色體上的一對隱性基因fgr控制。Bradbury等研究認為，fgr是編碼甜菜醛脫氫酶2的基因BAD2在第七外顯子發生8個堿基缺失和3處堿基變異，導致轉錄提前終止而使得BAD2酶喪失功能，進而使其的作用底物2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,?2AP)的代謝途徑中斷，香味物質2AP不斷積累，致使水稻的葉片和籽粒產生香味。針對該功能變異位點，基于凝膠電泳的功能標記GRFM04已被開發并用于香型水稻種質的鑒定。

成本低、簡便實用、重復性好的共顯性標記，是有效開展香稻分子輔助選擇育種的重要基礎。傳統凝膠電泳的分辨率有限，無法滿足廣泛存在的SNP或Indel檢測需求；此外，傳統的凝膠電泳操作費時、具有一定毒性，要實現大批量分離群體的標記檢測難度較大。因此，繼續開發新型功能型分子標記，是水稻分子育種進步的必然需求。

DNA序列的差異會導致DNA熔解溫度的不同，如果能利用DNA熔解溫度檢測基因型，將可避免凝膠電泳的缺陷，實現批量化、自動化、全封閉的基因型檢測。利用DNA熔解溫度判別基因型在人類疾病的研究中已有報道，但是，該技術涉及環節較多、需詳盡的前期優化工作，目前在水稻上系統開展此技術研究的報道較少，這在一定程度上限制了其在水稻育種中的廣泛應用。

發明內容

本發明要解決的技術問題克服目前傳統水稻香味基因檢測技術的缺陷，提供了一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標記。

本發明的另一個目的是提供一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標記的應用。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現：

一種水稻香味基因功能標記BAD2-E7，所述BAD2-E7由一對內側引物BAD2-E7-in-F/BAD2-E7-in-R和一對外側引物BAD2-E7-out-F/BAD2-E7-out-R組成，BAD2-E7-in-F、BAD2-E7-in-R、BAD2-E7-out-F和BAD2-E7-out-R引物序列如SEQ?ID?NO1~4所示。

一種如上所述水稻香味基因功能標記BAD2-E7的應用，所述應用為用于區分香型水稻和非香型水稻。

????一種區分香型水稻和非香型水稻的方法，包括以下步驟：

S1.?以待測水稻基因組DNA為模版，利用權利要求1所述的外側引物BAD2-E7-out-F/BAD2-E7-out-R進行PCR擴增；

S2.將步驟S1?PCR擴增的產物稀釋，以之為模版，利用權利要求1所述的內側引物BAD2-E7-in-F/BAD2-E7-in-R進行PCR擴增；

S3.檢測步驟S2擴增所獲的DNA的熔解溫度，如果待測DNA的熔解溫度在79~79.6℃之間，待測水稻為非香型水稻；如果待測DNA的熔解溫度在77.3~77.9℃之間，待測水稻為香型水稻。

本發明通過研究發現水稻香味基因fgr的熔解溫度為77.6℃，正常的等位基因BAD2的熔解溫度為79.3℃，水稻香味基因fgr的熔解溫度比正常的等位基因BAD2的熔解溫度低了1.7℃，所以，通過熔解溫度就可以區分fgr和BAD2序列差異，從而判別水稻材料的基因型（香味或非香味）。如果待測水稻的DNA的熔解溫度在79~79.6℃之間，可判斷待測水稻為非香型水稻，如果待測DNA的熔解溫度在77.3~77.9℃之間，可判斷待測水稻為香型水稻。

不同品種的香型水稻都含有水稻香味基因fgr，不同品種的香型水稻的fgr基因序列的相似度在99.5%以上，所以，只要是是香型水稻，無論是什么品種，通過BAD2-E7標記擴增的DNA序列的熔解溫度都會在77.6℃左右范圍，這個范圍前后不會超過0.3℃。