[發明專利]一種利用DNA熔解溫度分析水稻稻瘟病抗性基因的功能標記

有效

• 申請號: 201310238656.2
• 申請日: 2013-06-17
• 公開（公告）號: CN103333886A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 郭濤;羅文龍;陳志強;王慧;黃翠紅;肖武名;劉永柱;張建國
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 謝敏楠

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用DNA熔解溫度分析水稻稻瘟病抗性基因的功能標記開發。

背景技術

水稻是我國重要的農作物，其產量的穩定性直接關系到國計民生。稻瘟病是水稻的毀滅性病害，對水稻的產量造成重大影響，高抗稻瘟病一直是水稻新品種培育的關鍵目標。提高稻瘟病抗性最有效的方法是培育攜帶抗病基因的品種，這就需要對抗病基因的準確高效鑒定。傳統的稻瘟病抗性檢測，是通過人工剪葉然后接種稻瘟病菌的方式鑒定，該方法檢測結果穩定性較差、周期較長、技術條件要求高，無法滿足在育種低世代大群體的鑒定要求。最有效的抗性鑒定方法，應是直接對稻瘟病抗性基因進行選擇。

????研究表明，稻瘟病抗性基因Pik位于11染色體長臂，對許多中國稻瘟病小種有較強的、穩定的抗性。Pik基因座位兩個連續的NBS-LRR類基因（Pik-1和Pik-2）組成，兩個基因對Pik介導的稻瘟病抗性均必不可少。Pik座位上已定位或克隆的抗性復等位基因包括Pik(供體Kusabue)、Pikh(供體Tetep)、Pik-H4(供體H4)、Pikp(供體K60)、Pikm(供體Tsuyuake)、Piks(供體Norin)、Pi1(供體LAC23)等。盡管Pik座位的不同抗性復等位基因之間的抗譜有所差別，但抗性都較好。Pik對應日本晴（含稻瘟病感病基因pik）基因組的兩個基因分別為LOC_Os11g46200（pikm5-NP）和LOC_Os11g46210（pikm6-NP），其中Pik-2在不同等位基因之間相對較保守。以已克隆的多個抗性復等位基因的Pik-2和LOC_Os11g46210進行多重序列比對，發現在抗性復等位基因與日本晴pik在第2173位堿基處存在SNP變異，其中抗性基因為T，而感病基因為C。針對該位點，目前并未報道合適的分子標記，只能利用基因測序的手段分析基因型。基因測序技術環節復雜、成本高，很顯然并不適合大規模育種群體的篩選。

????成本低、簡便實用、重復性好的共顯性標記，是有效開展分子輔助選擇育種的重要基礎。DNA序列的差異會導致DNA熔解溫度的不同，如Pik和pik兩種等位基因在第2173位的T/C變異，將導致該DNA區段Pik比pik的熔解溫度低1℃。如果能利用DNA熔解溫度檢測基因型，將可避免基因測序的缺陷，實現對大規模育種群體的基因型檢測。利用DNA熔解溫度判別基因型在人類疾病的研究中已有報道，但是，該技術涉及環節較多、需詳盡的前期優化工作，目前在水稻上系統開展此技術研究的報道較少，這在一定程度上限制了其在水稻育種中的廣泛應用。

發明內容

為了解決背景技術的技術問題，本發明提供一種稻瘟病抗性基因功能標記Pik-C/T，所述的Pik-C/T由兩對引物Pik-C/T-out、Pik-C/T-in構成，引物序列如下：

????Pik-C/T-out：正向引物序列（5’-3’）為SEQ?ID?NO:1?CAATGCCAGCACTCGAAATCAT；反向引物序列（5’-3’）?為SEQ?ID?NO:2?CAGTGACGATGCCATCAACAAA，

Pik-C/T-in：正向引物序列（5’-3’）為SEQ?ID?NO:3?TGAAAATCTCCGTGAGGTGCAT；反向引物序列（5’-3’）為SEQ?ID?NO:4?TTGGTTATTGCTTCTGCCCCAT。

????根據需求提供該區別稻瘟病抗性基因功能標記Pik-C/T的應用，所述的應用為區分稻瘟病抗性基因與稻瘟病感病基因。

????并根據實際的需要，提供一種區分稻瘟病抗性基因Pik與稻瘟病感病基因pik的方法，包括以下步驟：

S1.?以待測基因組DNA為模版，利用根據權利要求1所述的Pik-C/T-out擴增；

S2.?將步驟S1擴增所得的基因組稀釋，并以之為模版，利用根據權利要求1所述的Pik-C/T-in擴增；

S3.?利用儀器檢測步驟S2擴增所獲的DNA的熔解溫度，如果待測DNA的熔解溫度在78.5~79.1℃之間，待測水稻為抗稻瘟病水稻，如果待測DNA的熔解溫度在79.5~80.1℃之間，待測水稻為感稻瘟病水稻。