[發明專利]一種批量提取水稻胚乳DNA的方法

有效

• 申請號: 201310238655.8
• 申請日: 2013-06-17
• 公開（公告）號: CN103436524A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 郭濤;羅文龍;陳志強;王慧;陳海英;劉永柱;張建國
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 謝敏楠

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技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種批量提取水稻胚乳DNA的方法。

背景技術

水稻是我國重要的糧食作物，高產、優質、多抗水稻新品種的培育是提升我國糧食安全的重要環節。隨著分子標記的出現，利用分子標記輔助選擇提高新品種培育效率已得到了廣泛應用。

水稻DNA的制備是進行分子標記輔助選擇的前提，在提取時應根據不同研究需要，保證其結構的相對完整性；盡量排除其他大分子成分如蛋白質、多糖等的污染。以水稻葉片為材料，利用CTAB進行DNA提取，是目前廣泛應用的方法，該方法DNA提取量較多、純度也較高，可滿足大部分分子生物學研究要求。但該方法有機試劑處理次數過多、耗時長、成本高。前人已經研究了部分DNA提取的簡化方法，如簡化的CTAB法、TritonX-100法、NaOH提取法等，但這些方法都存在各種缺點（如效率低、有毒試劑使用等），無法滿足大批量群體的DNA抽提工作。此外，一般的DNA抽提以葉片為材料，必然受到水稻生長季節的限制，特別是在需篩選目的基因型單株移栽時，其時間的要求更加緊迫。如能利用水稻胚乳提取DNA，可將基因型鑒定工作提早一個世代，對于育種工作的安排更加有利。

目前，利用水稻籽粒提取DNA的研究已有報道，但已有的研究操作步驟繁瑣、不能進行批量化提??；此外，現有的籽粒提取DNA是破壞性的方法，籽粒被完全破壞，無法繼續種植。因此，有必要探討一種批量化的水稻胚乳DNA提取方法，使其更好的應用于水稻育種。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，為了克服現有技術中水稻DNA提取技術的上述不足，提供一種批量提取水稻胚乳DNA的方法。

本發明所要解決的上述技術問題，通過以下技術方案予以解決：

一種批量提取水稻胚乳DNA的方法，包括如下步驟：

S1.從水稻種子中切取胚乳；

S2.將胚乳投入PCR板孔中，所述的PCR板命名為T1板；

S3.T1板每孔加入50?~150μL堿液，放入PCR?儀中進行加熱；

S4.取出T1板，每孔投入鎢合金珠及150?~250μL?1×DNA抽提液；

S5.將T1板重新置于PCR儀中進行加熱；

S6.取出T1板，振動3~4?min；

S7.將T1板放入離心機進行離心；

S8.取出T1板，將上清液轉移至另一PCR板中，PCR板命名為T3板，T3

板每孔中預先加入50~150?μL?雙蒸水；

S9.?將T3板置于冰箱中保存；

S4中1×DNA抽提液的組成為pH9.5的Tris、EDTA、?KCl，它們的摩爾比為5~15:0.5~1.5:50~150。

該方法提取快速、不使用有毒的提取試劑，而且利用水稻胚乳提取DNA，可將基因型鑒定工作提早一個世代，對于育種工作的安排更加有利。

作為一種優選方案，S1中所述從水稻種子中切取胚乳是指從每粒水稻種子切取1/3的胚乳。

作為一種優選方案，S2中每個PCR板孔中投入5~8mg胚乳。

作為一種優選方案，S2中所述的堿液為1?mol/?L?NaOH溶液；加入量為100μL。

作為一種優選方案，S3中的PCR條件為99?℃?15?min。

作為一種優選方案，S4中1×DNA抽提液的每孔用量為180μL；Tris?、EDTA和KCl的摩爾比為10:1:100；鎢合金珠每孔加入1粒。

作為一種優選方案，S5中的PCR條件為99?℃，3?min。

作為一種優選方案，S7中以5000?rpm?離心1?min。

作為一種優選方案，所述的T1板和T3板為96孔板。

作為一種優選方案，S8中使用96針復制器轉移上清液。

作為一種優選方案，S9中所述的保存是指置于-20℃冰箱中保存。

本發明與現有技術相比具有以下優點：

1）本方法以水稻籽粒1/3胚乳為DNA抽提材料，而通常的DNA抽提以葉片為材料，本方法在時間安排上更加靈活。

2）本方法以水稻籽粒1/3胚乳，剩余的籽粒部分（胚乳和胚）仍然保留可以繼續種植，而通常的水稻籽粒DNA抽提以整個籽粒為材料，提取DNA后無法種植。

3）本方法1×DNA抽提液配方如下：10mM?Tris?（pH9.5），1mM?EDTA，100?mM?KCl；不含有毒的酚-氯仿等試劑，對于操作人員更加安全。