[發(fā)明專利]一種從發(fā)酵液中分離提取乳酸片球菌素PA-1的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310237976.6
• 申請(qǐng)日: 2013-06-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103288932A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張健;張穎;周志江;韓燁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/195
• 分類號(hào): C07K14/195;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一種利用膜分離技術(shù)，尤其是一種從發(fā)酵液中分離提取乳酸片球菌素PA-1的方法。

背景技術(shù)

乳酸片球菌素PA-1（Pediocin?PA-1）是由44個(gè)氨基酸組成的具有抗菌活性的小肽，其等電點(diǎn)為9.6，理論分子量為4624Da。乳酸片球菌素PA-1最早是在乳酸片球菌PAC1.0中發(fā)現(xiàn)的，并因此被冠名。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)除了乳酸片球菌外，乳酸菌的其它屬、種微生物，如植物乳桿菌（Lactobacillus?plantarum）和小片球菌（Pediococcus?parvulus）也能產(chǎn)生乳酸片球菌素PA-1。

乳酸片球菌素PA-1的抑菌范圍為親緣關(guān)系相近的乳酸菌和部分非乳酸菌的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，尤其對(duì)食品中常見(jiàn)致病菌和腐敗菌，如單細(xì)胞增多癥李氏桿菌和梭狀芽孢桿菌有很好的抑菌效果。此外，乳酸片球菌素PA-1具有較好的耐熱、耐酸、耐有機(jī)溶劑等特性，這些特性證明了乳酸片球菌素PA-1具有很好的食品防腐劑的開(kāi)發(fā)潛力。

目前，對(duì)乳酸片球菌素PA-1的提取純化方法報(bào)道的很多，與普通的蛋白純化類似，多為細(xì)菌素的濃縮結(jié)合各級(jí)色譜純化，這些方法適合實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模純化，可以達(dá)到理想的純度，但步驟繁瑣，收率損失較大，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。2008年，Naghmouchi等人首次報(bào)道了親和色譜一步純化乳酸片球菌素PA-1，這種方法簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，但親和色譜填料成本昂貴，再生困難。

從科學(xué)研究的角度分析，我們需要大量的（毫克級(jí)）高純度的乳酸片球菌素PA-1進(jìn)行更為深入的生化結(jié)構(gòu)解析和構(gòu)效研究；從應(yīng)用的角度分析，我們需要大量的（克級(jí)）、不用很高純度的細(xì)菌素產(chǎn)品來(lái)直接應(yīng)用。無(wú)論如何，現(xiàn)有的鹽析結(jié)合各級(jí)色譜純化的方法都過(guò)于繁瑣，大量純化成本也太高；因此，開(kāi)發(fā)更為簡(jiǎn)便，更有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的工業(yè)化級(jí)別的純化方法很有必要。

膜分離技術(shù)兼有分離、濃縮、純化和精制的功能，是當(dāng)今循環(huán)經(jīng)濟(jì)時(shí)代最受矚目的一項(xiàng)高新技術(shù)，膜分離技術(shù)的出現(xiàn)，為工業(yè)化規(guī)模純化細(xì)菌素提供了新的、可行的思路，利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取乳酸片球菌素PA-1還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種從發(fā)酵液中分離提取乳酸片球菌素PA-1的方法，本方法利用膜分離技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、耗能少、污染小、成本低、易于工業(yè)化生產(chǎn)和適用于多種后續(xù)純化方法等諸多優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是：

一種從發(fā)酵液中分離提取乳酸片球菌素PA-1的方法，步驟如下：

⑴發(fā)酵液預(yù)處理

取含乳酸片球菌素PA-1的發(fā)酵液，60-80℃恒溫水浴處理30-60分鐘，冷卻至20-30℃，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0-3.0，攪拌，釋放乳酸片球菌素PA-1于發(fā)酵液中；

⑵板框過(guò)濾

在發(fā)酵液中加入0.5-1.2%的助濾劑，攪拌，進(jìn)行板框過(guò)濾，棄去濾餅，收集濾液；

⑶微濾除雜

將板框過(guò)濾后的濾液在溫度25-35℃，壓力為1.0-1.5MPa下通過(guò)金屬氧化膜或陶瓷膜過(guò)濾，膜的孔徑為5μm，微濾至體積濃縮比3-6倍時(shí)，開(kāi)始洗濾，洗濾液的體積和濃縮液體積相同，最終使?jié)饪s液為初始進(jìn)料液體積的4-7%，滲透液為乳酸片球菌素PA-1的粗提液；

⑷超濾除雜

步驟⑶得到的滲透液在溫度20-30℃，壓力為0.05-0.1MPa下，通過(guò)截留分子量為10000-30000道爾頓的超濾膜，超濾至體積濃縮比為4-6時(shí)，加入和濃縮液等量的水進(jìn)行洗濾，至最終濃縮液為料液體積的4-10%為止，收集濾液；

⑸超濾除雜濃縮

步驟⑷得到的濾液通過(guò)截留分子量為1000-3000道爾頓的超濾膜過(guò)濾，超濾操作溫度20-30℃，壓力為0.05-0.1MPa，超濾至體積濃縮比為8-12時(shí)為止，收集濃縮液；

⑹噴霧干燥

步驟⑸得到的濃縮液，加入填料固體食鹽，在噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥，進(jìn)口溫度為120-170℃，出口溫度為70-90℃，使噴霧干燥后含鹽量為25-35%，噴霧干燥，即得乳酸片球菌素PA-1；

而且，所述助濾劑為硅藻土或珍珠巖。

而且，所述超濾膜為中空纖維膜。

而且，所述步驟⑸超濾除雜濃縮后經(jīng)過(guò)如下步驟，獲得乳酸片球菌素PA-1的白色粉末：

⑺C18制備色譜純化

步驟⑸得到的濃縮液，經(jīng)反相C18制備色譜純化，收集保留時(shí)間15.0-15.4分鐘的蛋白峰為乳酸片球菌素PA-1活性峰；

⑻冷凍干燥