[發明專利]一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法

有效

• 申請號: 201310236974.5
• 申請日: 2013-06-15
• 公開（公告）號: CN103266086A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發明（設計）人: 陳玉強;王勇軍;顏江華;王生育
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第一七四醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及樹突狀細胞，尤其是涉及一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法。

背景技術

樹突狀細胞（dendritic?cells,DC）是目前已知體內抗原遞呈能力最強、唯一能活化初始型T淋巴細胞的抗原遞呈細胞。DC以主要組織相容性復合物（major?histocompatibility?complex,MHC）-多肽復合物的形式遞呈抗原，在天然免疫和獲得性免疫中發揮著極其重要的作用，引起當前腫瘤免疫治療的密切關注。

大量的研究表明，DC與腫瘤的發生發展及預后關系密切，腫瘤的發生可能與腫瘤浸潤性DC或宿主DC功能缺陷有關，在此情況下，腫瘤患者體內的DC處于一種“無能狀態”，無法有效地遞呈腫瘤抗原，激活T細胞識別并殺傷腫瘤細胞。可能的原因是由于腫瘤分泌產生的可溶性免疫抑制因子和某些細胞因子抑制了DC的免疫監視和應答功能，從而發生免疫逃逸。此外，DC在活化過程中本身存在的負反饋調節機制也影響了DC免疫功能的發揮。研究發現，細胞因子信號抑制因子（Suppressor?of?cytokine?signaling，SOCS）家族成員SOCS1在DC的免疫負反饋調節中起著重要作用。采用基因敲除或siRNA技術阻斷或抑制SOCS1的表達和功能發揮能明顯增強DC的抗原遞呈功能和更好地誘發特異性抗腫瘤免疫應答。值得一提的是，SOCS1拮抗劑，即pJAK2(1001–1013)多肽（1.Waiboci?LW,Ahmed?CM,Mujtaba?MG,Flowers?LO,Martin?JP,Haider?MI,Johnson?HM.Both?the?suppressor?of?cytokine?signaling1(SOCS-1)kinase?inhibitory?region?and?SOCS-1mimetic?bind?to?JAK2autophosphorylation?site:implications?for?the?development?of?a?SOCS-1antagonist.J?Immunol.2007,178:5058-5068），能增強免疫細胞的抗病毒能力和T細胞的免疫殺傷作用，間接證明了pJAK2(1001–1013)多肽能有效抑制SOCS1的負調節效應（2.Ahmed?CM,Dabelic?R,Martin?JP,Jager?LD,Haider?SM,Johnson?HM.Enhancement?of?antiviral?immunity?by?small?molecule?antagonist?of?suppressor?of?cytokine?signaling.J?Immunol.2010,185:1103-1113），故pJAK2(1001–1013)多肽有望在扭轉DC功能缺陷或改善DC抗原遞呈功能上發揮重要作用。目前，采用pJAK2(1001–1013)多肽修飾而獲得有效遞呈抗原的樹突狀細胞及其制備方法尚未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法，該方法可改善樹突狀細胞抗原遞呈功能和特異性免疫應答水平，采用SOCS1拮抗劑，即pJAK2(1001–1013)多肽，修飾胃癌細胞總RNA轉染的樹突狀細胞。

本發明包括如下步驟：

1）胃癌細胞MGC-803總RNA的提取、鑒定：采用試劑從胃癌細胞MGC-803中提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度、瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA分子量大小；

2）SOCS1拮抗劑pJAK2(1001－1013)多肽的合成；

3）外周血單個核細胞（PBMC）的分離；

4）單核細胞（Monocyte）的獲取：采用“人CD14⁺單核細胞分離試劑盒”從步驟3）分離得到的PBMC中分選出單核細胞；

5）未成熟樹突狀細胞（iDC）的體外誘導：將步驟4）獲取的單核細胞在RPMI-1640培養基中經細胞因子GM-CSF和IL-4誘導培養后即產生未成熟樹突狀細胞（iDC）；

6）RNA轉染未成熟樹突狀細胞；

7）pJAK2(1001－1013)多肽負載RNA轉染的樹突狀細胞：pJAK2(1001–1013)多肽與經RNA電穿孔轉染的iDC孵育4h進行負載；

8）未成熟樹突狀細胞（iDC）的成熟誘導：將步驟6）和7）經RNA轉染和SOCS1拮抗劑pJAK2(1001-1013)多肽負載后的iDC采用LPS和TNF-α誘導后，即可產生成熟樹突狀細胞（mDC）。