[發(fā)明專利]一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細(xì)胞的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310236974.5
• 申請日: 2013-06-15
• 公開（公告）號: CN103266086A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳玉強;王勇軍;顏江華;王生育
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第一七四醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

1.一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

1）胃癌細(xì)胞MGC-803總RNA的提取、鑒定：采用試劑從胃癌細(xì)胞MGC-803中提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度、瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA分子量大小；

2）SOCS1拮抗劑pJAK2(1001－1013)多肽的合成；

3）外周血單個核細(xì)胞的分離；

4）單核細(xì)胞的獲取：采用人CD14⁺單核細(xì)胞分離試劑盒從步驟3）分離得到的PBMC中分選出單核細(xì)胞；

5）未成熟樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)：將步驟4）獲取的單核細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中經(jīng)細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)后即產(chǎn)生未成熟樹突狀細(xì)胞；

6）RNA轉(zhuǎn)染未成熟樹突狀細(xì)胞；

7）pJAK2(1001－1013)多肽負(fù)載RNA轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞：pJAK2(1001–1013)多肽與經(jīng)RNA電穿孔轉(zhuǎn)染的iDC孵育4h進行負(fù)載；

8）未成熟樹突狀細(xì)胞的成熟誘導(dǎo)：將步驟6）和7）經(jīng)RNA轉(zhuǎn)染和SOCS1拮抗劑pJAK2(1001－1013)多肽負(fù)載后的iDC采用LPS和TNF-α誘導(dǎo)后，即可產(chǎn)生成熟樹突狀細(xì)胞。

2.如權(quán)利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟3）中，所述外周血單個核細(xì)胞的分離采用密度梯度離心法從健康志愿者外周血中分離PBMC。

3.如權(quán)利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟4）中，所述分選參照試劑盒的操作說明。

4.如權(quán)利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟5）中，所述細(xì)胞因子GM-CSF的使用終濃度為1000U/ml，所述IL-4的使用終濃度為800U/ml。

5.如權(quán)利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟5）中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為5d。

6.如權(quán)利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟6）中，所述RNA轉(zhuǎn)染未成熟樹突狀細(xì)胞采用電穿孔的方式進行RNA轉(zhuǎn)染。

7.如權(quán)利要求6所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于所述采用電穿孔的方式進行RNA轉(zhuǎn)染的條件為：RNA轉(zhuǎn)染濃度為5.0μg?RNA/2×10⁵DC，電壓300V、電容150μF、電阻99Ω、脈沖時間為5～6s。

8.如權(quán)利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟7）中，所述iDC孵育的時間為4h。

9.如權(quán)利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟8）中，所述SOCS1拮抗劑pJAK2(1001-1013)多肽負(fù)載后的iDC的使用終濃度為30μM；所述LPS的使用終濃度可為1.0μg/ml，TNF-α的使用終濃度可為50ng/ml。

10.如權(quán)利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟8）中，所述誘導(dǎo)的時間為24h。