[發明專利]一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法

有效

• 申請號: 201310236974.5
• 申請日: 2013-06-15
• 公開（公告）號: CN103266086A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發明（設計）人: 陳玉強;王勇軍;顏江華;王生育
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第一七四醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

1.一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

1）胃癌細胞MGC-803總RNA的提取、鑒定：采用試劑從胃癌細胞MGC-803中提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度、瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA分子量大小；

2）SOCS1拮抗劑pJAK2(1001－1013)多肽的合成；

3）外周血單個核細胞的分離；

4）單核細胞的獲取：采用人CD14⁺單核細胞分離試劑盒從步驟3）分離得到的PBMC中分選出單核細胞；

5）未成熟樹突狀細胞的體外誘導：將步驟4）獲取的單核細胞在RPMI-1640培養基中經細胞因子GM-CSF和IL-4誘導培養后即產生未成熟樹突狀細胞；

6）RNA轉染未成熟樹突狀細胞；

7）pJAK2(1001－1013)多肽負載RNA轉染的樹突狀細胞：pJAK2(1001–1013)多肽與經RNA電穿孔轉染的iDC孵育4h進行負載；

8）未成熟樹突狀細胞的成熟誘導：將步驟6）和7）經RNA轉染和SOCS1拮抗劑pJAK2(1001－1013)多肽負載后的iDC采用LPS和TNF-α誘導后，即可產生成熟樹突狀細胞。

2.如權利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟3）中，所述外周血單個核細胞的分離采用密度梯度離心法從健康志愿者外周血中分離PBMC。

3.如權利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟4）中，所述分選參照試劑盒的操作說明。

4.如權利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟5）中，所述細胞因子GM-CSF的使用終濃度為1000U/ml，所述IL-4的使用終濃度為800U/ml。

5.如權利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟5）中，所述誘導培養的時間為5d。

6.如權利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟6）中，所述RNA轉染未成熟樹突狀細胞采用電穿孔的方式進行RNA轉染。

7.如權利要求6所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法，其特征在于所述采用電穿孔的方式進行RNA轉染的條件為：RNA轉染濃度為5.0μg?RNA/2×10⁵DC，電壓300V、電容150μF、電阻99Ω、脈沖時間為5～6s。

8.如權利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟7）中，所述iDC孵育的時間為4h。

9.如權利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟8）中，所述SOCS1拮抗劑pJAK2(1001-1013)多肽負載后的iDC的使用終濃度為30μM；所述LPS的使用終濃度可為1.0μg/ml，TNF-α的使用終濃度可為50ng/ml。

10.如權利要求1所述一種有效遞呈胃癌抗原的樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟8）中，所述誘導的時間為24h。