[發明專利]一種制備丙酮酸氧化酶的方法

有效

• 申請號: 201310236929.X
• 申請日: 2013-06-14
• 公開（公告）號: CN103275941A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 董永勝
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種制備丙酮酸氧化酶的方法，特別涉及利用雙水相萃取技術制備丙酮酸氧化酶的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

丙酮酸氧化酶（Pyruvate?oxidase，EC1.2.3.3）是一種用途廣泛的臨床診斷用酶制劑，主要用于血液中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）的活力測定，此外，還用于丙酮酸激酶活性測定以及丙酮酸、無機磷酸、尿素等化合物的測定。

丙酮酸氧化酶的制備采用微生物發酵法，即通過培養具有高活性丙酮酸氧化酶的微生物細胞如植物乳桿菌（Lactobacillus?plantarum）、綠色氣球菌（Aerococcus?viridans）等獲得，其制備過程包括微生物細胞的培養和酶的分離純化。在丙酮酸氧化酶的生產成本構成中，分離純化等下游工序的成本占有相當大的比例，因此，如何采用高效的分離技術是丙酮酸氧化酶生產中需要解決的技術問題。

目前，丙酮酸氧化酶的分離純化方法主要采用鹽析法、凝膠色譜法、離子交換法等，如陶家權（華東理工大學碩士論文，2007）在進行丙酮酸氧化酶研究時，對重組大腸桿菌中的丙酮酸氧化酶采用Ni-IDA親和層析的純化方法，得到的丙酮酸氧化酶的酶比活力為1.21U/mg、酶回收率為23.1％、純化倍數為7.1；該研究還采用硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose離子交換、UltrogelAcA34凝膠過濾三步純化的方法，得到的丙酮酸氧化酶的酶比活力為1.1U/mg、酶回收率為29.8％、純化倍數為10。中國專利文獻CN101659943A（申請號200910092897.4）采用鎳柱親和層析、硫酸銨沉淀、葡聚糖凝膠G-25層析柱脫鹽方法獲得了丙酮酸氧化酶。上述方法存在工藝復雜、生產周期較長、酶活力回收率低、不能連續生產等問題，從而導致了丙酮酸氧化酶的生產成本較高。因此，改進現有生產技術以及開發新的生產技術以降低丙酮酸氧化酶的生產成本勢在必行。

雙水相萃取技術是近年來發展起來的生物分離技術，是分離純化生物活性物質的有效方法。雙水相系統是指兩種不同種類的聚合物水溶液混合或者一種聚合物水溶液和一種鹽溶液混合后，當兩者濃度達到一定值時，混合液靜置后分層產生的兩液相系統。雙水相系統萃取的原理是基于生物物質在體系中的選擇性分配。雙水相萃取具有操作條件溫和、處理量大、分離步驟少、能耗低，無有機溶劑殘留，易于工業化操作等優點。目前雙水相萃取已被廣泛地應用于生物工程技術領域進行生物轉化、蛋白質（酶）及核酸等生物大分子的分離純化等方面。

在生化分離工程中常用的雙水相體系是聚合物/聚合物體系以及聚合物/無機鹽體系，聚合物/聚合物體系如：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）體系。由于PEG/葡聚糖體系形成的下相中葡聚糖的黏度非常高，經常會產生凝膠狀物質，使溶液的過程控制產生困難，限制了PEG/葡聚糖系統的應用。

除了聚合物/聚合物體系以及聚合物/無機鹽體系之外，還有一些有機溶劑（如醇類）和無機鹽也能形成雙水相體系，該體系也可用于蛋白質（酶）的分離，如中國專利文獻CN101693735A（申請號200910309154.8），公開了一種雙水相萃取分離蛋白質和酶的方法，其特點在于將多元醇與無機鹽按比例直接加入到蛋白質或酶溶液中，攪拌均勻，室溫下靜置，形成兩相，蛋白質或酶主要分配到上相，且保留較高的活性，從而達到有效的分離提取目的。但由于多元醇的分子量較聚合物（如PEG）的分子量小很多，多元醇和無機鹽在形成雙水相體系時，兩者在體系中需要至少有一種具有較高的濃度（相對于聚乙二醇/無機鹽體系），多元醇作為一種有機溶劑，當其濃度較高時，酶在其溶液中活力會下降，且隨著其濃度的增高，酶活性下降也增加；當無機鹽濃度較高時，酶蛋白會因鹽析作用而產生沉淀，從而導致酶活力回收率的下降。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種工藝簡單、酶活力回收率高、生產成本低，便于規模化生產的丙酮酸氧化酶的制備方法。

本發明的方法是利用聚乙二醇/無機鹽雙水相萃取技術制備丙酮酸氧化酶，從而達到降低生產成本，取得較好經濟效果的目的。

為實現上述目的，本發明采取的具體技術方案如下：

一種利用雙水相萃取體系制備丙酮酸氧化酶的方法，包括以下步驟：

（1）將含丙酮酸氧化酶的微生物細胞進行培養，得細胞培養液，離心，制得濕菌體細胞，將菌體細胞重懸于去離子水中，制得細胞懸浮液，破碎細胞，得到細胞破碎液；