[發(fā)明專利]一種制備丙酮酸氧化酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310236929.X
• 申請(qǐng)日: 2013-06-14
• 公開（公告）號(hào): CN103275941A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董永勝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 齊魯工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

1.一種利用雙水相萃取體系制備丙酮酸氧化酶的方法，包括以下步驟：

（1）將含丙酮酸氧化酶的微生物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得細(xì)胞培養(yǎng)液，離心，制得濕菌體細(xì)胞，將菌體細(xì)胞重懸于去離子水中，制得細(xì)胞懸浮液，破碎細(xì)胞，得到細(xì)胞破碎液；

（2）配制無機(jī)鹽水溶液，向該無機(jī)鹽水溶液中添加聚乙二醇，在總體系中無機(jī)鹽的質(zhì)量百分比濃度為10～20wt%、聚乙二醇的質(zhì)量百分比濃度為20～30wt%，混合均勻，制得聚乙二醇/無機(jī)鹽雙水相體系溶液；

（3）向步驟（1）制得的細(xì)胞破碎液中加入步驟（2）制得的聚乙二醇/無機(jī)鹽雙水相體系溶液，雙水相體系溶液與細(xì)胞破碎液的體積比為1：（1～2），混合均勻，靜置分相，制得無機(jī)鹽下相溶液和含有丙酮酸氧化酶的聚乙二醇上相溶液；

（4）向步驟（3）制得的聚乙二醇上相溶液中加入無機(jī)鹽，使無機(jī)鹽在總體系中的質(zhì)量濃度為6～10wt%，混合均勻，靜置分相，制得二次分離的無機(jī)鹽下相溶液和含有丙酮酸氧化酶的二次分離的聚乙二醇上相溶液；

（5）向步驟（4）制得的聚乙二醇上相溶液中加入無機(jī)鹽，使無機(jī)鹽在總體系中的質(zhì)量濃度為5～6wt%，調(diào)節(jié)溶液的pH值為5.5～6.0，混合均勻，靜置分相，制得含有丙酮酸氧化酶的無機(jī)鹽下相溶液和聚乙二醇上相溶液；

（6）將步驟（5）制得的含有丙酮酸氧化酶的無機(jī)鹽下相溶液，采用超濾膜過濾濃縮，收集截留液，冷凍干燥，制得丙酮酸氧化酶。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中的離心條件為：3000～5000r/min離心10～20min。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中的細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞質(zhì)量百分比濃度為25～35%。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中的破碎細(xì)胞采用高壓細(xì)胞破碎機(jī)，操作壓力為50～60MPa，操作溫度為5～15℃。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）、（3）、（4）、（5）、（6）中的無機(jī)鹽選自硫酸銨、硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鉀或酒石酸鉀鈉之一。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）、（3）、（4）、（5）中的聚乙二醇分子量為1000、1500或2000之一。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3）、（4）、（5）中的靜置分相時(shí)間為10～60min。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（6）中的超濾膜工作壓力為0.1～0.3MPa，膜的截留分子量為40000～50000Dal，操作溫度為25℃。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（5）還包括將聚乙二醇上相溶液經(jīng)回收用的超濾膜過濾濃縮后，參與配制步驟（2）中聚乙二醇/無機(jī)鹽雙水相體系溶液的步驟。

10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的回收用的超濾膜的截留分子量為2500Dal。