[發明專利]光激活單分子熒光生物化學反應動力學顯微鏡及試驗方法

有效

• 申請號: 201310236507.2
• 申請日: 2013-06-17
• 公開（公告）號: CN103344617A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 劉如川
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G02B21/06;G02B21/36
• 代理公司: 重慶大學專利中心 50201
• 代理人: 王翔

技術領域

????本發明涉及生物化學試驗領域，特別是一種光激活顯微跟蹤監測系統。

背景技術

在生物、化學等科學領域中，在分子水平跟蹤監測生物化學反應和信號發生過程有著重要的意義和作用，因為可以避免多步反應過程中多個分子同步的困難，也可以避免大量分子的復雜而不易調控的相互干擾，同時其獲得的更為詳盡的結果是常規體檢測技術得不到的。單分子熒光技術通常利用發光分子/基團來定位跟蹤單個目標分子，?探索生物化學過程的詳盡信息，因而在生物、化學、材料等研究領域都有著廣泛的應用。

然而單分子熒光技術的使用多局限于分子定位并跟蹤其位置的變化，或者分子的旋轉/空間構型變化，或者利用其自相關性來研究生物化學反應的平均動力學行為。在單分子水平上直接觀測生物化學反應的動力學過程卻一直是個難題，因為生物化學反應要求反應分子的濃度有個低限，而在這個濃度下熒光標志的目標分子往往會帶來過高的背景熒光而使得觀測單個熒光分子的發光無法實現。

光激活定位顯微技術利用光激活熒光基團/分子的光激活特性，通過控制激活光的強度和開關以控制光激活熒光基團/分子的發光與否，然后使用成像光激發激活態熒光基團/分子發出熒光，而未被激活的其它熒光基團/分子則不會發熒光。這樣每次僅激活有限數目的熒光基團/分子來降低實際發光分子的濃度，從而使這些分子相距光學顯微鏡的分辨率來分別單個分子的熒光，并用點擴散函數來定位每個分子。因而，光激活定位顯微技術適用的樣品往往是固定的樣品并需要多次成像才能得到一幅完整的分子高分辨分布圖。

然而，在單分子水平上直接觀測化學反應及蛋白質間相互作用（與生物體內信號發生過程密切相關），并捕捉其詳盡的動力學機制，技術的實現仍很困難，缺乏較普適的手段。

發明內容

本發明創造的目的是提供一種在分子水平監測生物化學反應的裝置。

為實現本發明創造目的而采用的技術方案是這樣的，一種光激活單分子熒光生物化學反應動力學顯微鏡，包括樣品臺、顯微鏡物鏡、成像激光發射器、相機和激活激光發射器。所述樣品臺的上表面承載透光襯底，所述樣品臺具有一個貫通上下表面的通孔，所述透光襯底覆蓋在所述通孔上。所述透光襯底的上表面承載著相互接觸時會發生生物化學反應的物質分子A和物質分子B，其中，所述物質分子A被固定在透光襯底的上表面，而物質分子B本身是可激活熒光分子或用可激活熒光基團標記了，實驗前，物質分子B溶解或懸浮在溶液中，實驗中，將物質分子B滴加到物質分子A中。所述透光襯底下方安裝顯微鏡物鏡，所述顯微鏡物鏡下方安裝相機。所述顯微鏡物鏡的前透鏡面向透光襯底的下表面，所述顯微鏡物鏡的主軸延長線與透光襯底的上表面交點為o點。所述成像激光發射器發射出的成像激光束和激活激光發射器發射出的激活激光束匯聚成一路光束后，以大于臨界角的入射角射入所述o點。

值得說明的是，本發明所涉及的發生生物化學反應的物質分子A和物質分子B即為實驗目標反應的分子/生物大分子，在實施例部分有若干舉例。將其中一種分子/生物大分子固定在透光襯底的上表面，即將其稀疏地連在透光襯底表面，連接方式可以采用一些常用的生物化學方法。本發明中，參與目標反應的一種分子/生物大分子在激活激光束照射較短時間（比如10微秒）后會發出熒光；或參與目標反應的一種分子/生物大分子在用可激活熒光基團標記后，再在激活激光束照射一定時間后會發出熒光。而該分子/生物大分子在不被激活激光束照射或過短時間（比如少于10微秒）照射均不會發出熒光。

本發明中，匯聚成一路光束的成像激光束和激活激光束后，以大于臨界角的入射角射入所述o點，即是使其在透光襯底與透光襯底表面溶液（物質分子A和物質分子B的反應溶液）的接觸界面發生全反射。所述臨界角即為光線從透光襯底（光密介質）射向透光襯底上表面溶液（光疏介質）時，剛好發生全反射的入射角。即激活激光束只能夠照射到透光襯底上表面的、參與目標反應的分子/生物大分子溶液的底部淺層（厚度約為100～300nm）。

本發明由于具有上述結構特征，可以用其進行生物化學反應動力學實驗。即本發明的另一個目的是提供一種光激活單分子熒光生物化學反應動力學試驗的方法，包括以下步驟：

1）將參與目標反應的物質A固定到透光襯底的上表面。即將其稀疏地連在玻璃透光襯底表面，連接方式可以采用一些常用的生物化學方法。