[發(fā)明專利]一種腫瘤外切酶體疫苗的提取方法及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310235443.4
• 申請日: 2013-06-14
• 公開（公告）號: CN103340903A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹利平;陳炯煌;闕日升
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: A61K35/16
• 分類號: A61K35/16;A61P35/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人腫瘤疫苗提取方法，尤其涉及一種腫瘤外切酶體（exosome）疫苗的提取方法以及應(yīng)用。

背景技術(shù)

手術(shù)治療是腫瘤的常規(guī)治療方法，除了手術(shù)治療外，過繼性細胞免疫治療也是目前極有潛力的一種腫瘤治療方法。相比其他治療手段，過繼性細胞免疫治療具有特異性高、副作用小、改善臨床體征、延長患者生存時間等優(yōu)點。體外和動物實驗研究表明，過繼性細胞對腫瘤細胞具有顯著的特異性殺傷效果。

exosome是由許多活細胞的多泡體(muhivesicular?bodies，MVBs)與細胞膜融合后向細胞外分泌的一種直徑50-100nm的小囊泡。腫瘤細胞來源的exosome已經(jīng)被證實可以表達豐富的免疫相關(guān)蛋白和腫瘤相關(guān)抗原，可以引起抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)，可能成為亞細胞結(jié)構(gòu)的腫瘤疫苗，因此具有重要的研究和應(yīng)用價值。原有提取exosome的方法只是將exosome這種完整的囊泡結(jié)構(gòu)提取出來，但是囊泡內(nèi)的大量miRNA以及腫瘤相關(guān)抗原無法提取。而恰恰是囊泡內(nèi)的miRNA以及腫瘤相關(guān)抗原才是激活免疫細胞的重要成分。所以很有必要發(fā)明一種提取exosome囊泡內(nèi)物質(zhì)的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤外切酶體（exosome）疫苗的提取方法，通過以下步驟實現(xiàn)：

?1.提取exosome：胎牛血清在4℃條件下，100000×g離心6h，除去內(nèi)源性exosome，人膽管癌細胞（RBE細胞）在含10％的胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)約72h，收集培養(yǎng)基上清。按藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）標(biāo)準(zhǔn)提取exosome：上清300×g離心5min、轉(zhuǎn)移至新的離心管800×g離心30min，轉(zhuǎn)移至新的離心管10000×g離心30min，去除細胞碎片；上清液再用millipore公司100?kd超濾管，以1500×g離心30min；將濃縮液移至30?g／L的蔗糖重水墊上，以100000×g超速離心60min。取出蔗糖重水墊，稀釋到50ml的PBS中，再用100kd?超濾管，以1500×g離心，直至體積<5?ml，以0.22um的濾器過濾除菌，分裝后置于—80℃冰箱備用。

2.提取exosome裂解超濾液：取超速離心后的exosome沉淀，加入去離子水10ml，低滲法使exosome破膜，用millipore公司10kd超濾管4000×g離心30min去除miRNA提純exosome裂解超濾液。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述方法在獲得不含miRNA的exosome裂解超濾液中應(yīng)用。

本發(fā)明從人膽管癌細胞（RBE細胞株）的培養(yǎng)液（購自中科院上海細胞庫）上清中成功提取了exosome，并且通過超濾裂解的方法提取了不含miRNA的exosome裂解超濾液，分別加入到未成熟的樹突狀細胞(imDC)與細胞毒性T淋巴細胞（CTL細胞）的混合培養(yǎng)體系中，使之產(chǎn)生特異性腫瘤細胞殺傷作用，實驗結(jié)果證明了通過裂解超濾的方法得到的不含miRNA的exosome裂解超濾液能夠更加明顯的刺激免疫細胞產(chǎn)生特異性的腫瘤殺傷作用，為基于exosome裂解超濾液的過繼性細胞免疫治療打下實驗基礎(chǔ)，并為腫瘤免疫治療提供新的方法與思路。

使用本發(fā)明可以在原有exosome提取的基礎(chǔ)上，將exosome囊泡內(nèi)的微小RNA、腫瘤抗原相關(guān)蛋白等大量具有腫瘤免疫原性的物質(zhì)充分釋放，同時又不破壞這些內(nèi)容物（含有大量miRNA以及大量腫瘤相關(guān)抗原），從而大大的提高exosome的腫瘤特異性免疫原性，以便于接下來的免疫識別、提呈、反應(yīng)等，實驗證明能大幅提高免疫細胞對腫瘤產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答的殺傷效果以及降低腫瘤細胞的免疫逃逸水平，即大大增強人體免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷能力。

附圖說明

圖1是普通DC/CTL細胞（DC/CTL組）、exosome致敏DC/CTL細胞（E-DC/CTL組）、exosome裂解超濾液致敏DC/CTL細胞（EL-DC/CTL組）分別殺傷RBE細胞的殺傷率對比圖。

圖2是exosome囊泡的電子顯微鏡圖片。?????圖3是exosome囊泡經(jīng)過裂解超濾法處理后的電子顯微鏡圖片。

圖4是正常生長的人膽管癌細胞（RBE細胞）圖片。

圖5是用exosome裂解超濾液致敏的DC/CTL細胞（樹突狀細胞與細胞毒性T淋巴細胞）殺傷RBE細胞后的倒置顯微鏡圖片。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例一