[發(fā)明專利]一種豬血清中豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310234942.1
• 申請日: 2013-06-13
• 公開（公告）號: CN103267847A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹杰
• 申請（專利權(quán)）人: 天津天澤畜禽養(yǎng)殖專業(yè)合作社
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于豬血清檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種豬血清中豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測方法。

背景技術(shù)

豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus?pleuropneumoniae，APP）引起的一種呼吸道傳染病，以急性出血性纖維素性胸膜炎和慢性纖維素性壞死性肺炎為特征。該病自1957年在英國發(fā)現(xiàn)以來，已在世界范圍內(nèi)廣泛流行，成為國際上公認的危害現(xiàn)代豬業(yè)的五大疫病之一。該病雖在我國發(fā)現(xiàn)較晚，但對養(yǎng)殖業(yè)危害較為嚴重，已成為我國病豬業(yè)中呼吸道病的三大常發(fā)病之一。

豬胸膜肺炎放線桿菌的現(xiàn)有檢測方法很多，大致可以分為三大類，即病原學(xué)診斷方法、血清學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷法。病原學(xué)診斷方法需要細菌分離、培養(yǎng)和鑒定，周期較長；血清學(xué)診斷方法包括補體結(jié)合反應(yīng)、熒光抗體、間接血液凝集試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等，血清學(xué)診斷方法的缺點是只能檢測動物體內(nèi)胸膜肺炎放線桿菌的抗體而無法檢測病原；分子生物學(xué)診斷方法主要包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)與熒光核酸探針，分子生物學(xué)方法比前兩種方法快速、靈敏，但需要使用特殊的儀器，如PCR儀，而熒光探針的制備比較昂貴，不適于基層應(yīng)用。

但是，有時通過上述檢測方法單一使用進行檢測時，經(jīng)常檢測結(jié)果不穩(wěn)定，有時會出現(xiàn)誤差，這也給豬的養(yǎng)殖及防病、抗病帶來了極大的不便。

通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請相關(guān)的專利公開文獻。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種方法簡便、檢測結(jié)果準(zhǔn)備、靈敏度高的豬血清中胸膜肺炎放線桿菌的檢測方法。

本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案是：

一種豬血清中豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測方法，步驟如下：

⑴隨機抽取規(guī)模場的仔豬及育肥豬血清樣品；

⑵間接血凝試驗檢測待檢豬血清中的豬胸膜肺炎放線桿菌抗體

①將豬胸膜肺炎放線桿菌間接血凝試劑盒中的陰陽性對照、抗原恢復(fù)室溫；

②在V型110度板上進行微量間接血凝試驗，200倍倍比稀釋血清，做陰陽性對照，加樣處理好后放入37℃恒溫箱中靜置1.5h后觀察判斷結(jié)果，豬血清中檢測到豬胸膜肺炎放線桿菌，檢測結(jié)果即為陽性；

⑶豬胸膜肺炎ELISA試劑盒檢測待檢豬胸膜肺炎放線桿菌抗體；

①將試劑盒取出，盒內(nèi)試劑恢復(fù)室溫并充分搖勻；

②將200倍稀釋后的樣本和對照加入板孔中，每孔50uL，陰陽性對照均為雙份；

③蓋上膜，37℃維持60min；

④去膜，用300uL的洗液清洗3次，最后一次在吸水紙上將平板拍干；

⑤每孔加50uL酶標(biāo)抗體；

⑥重復(fù)步驟③；

⑦重復(fù)步驟④；

⑧加入50uL底物溶液，輕搖2秒；

⑨將平板放入黑暗中在20-25℃作用15min；

⑩加入50uL終止液，輕搖2s，10min內(nèi)在405nm下讀數(shù)并記錄結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)試劑盒使用說明書判定，豬血清中檢測到豬胸膜肺炎放線桿菌，檢測結(jié)果即為陽性；

⑷步驟⑴及步驟⑵的檢測結(jié)果均為陽性，則豬血清中檢測到豬胸膜肺炎放線桿菌。

而且，所述步驟⑴中豬胸膜肺炎放線桿菌間接血凝試劑盒購自蘭州獸醫(yī)研究所。

而且，所述步驟⑵中豬胸膜肺炎ELISA試劑盒購自法國LSI公司。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：

本發(fā)明檢測方法采用APP間接血凝試驗與APPELISA試驗的聯(lián)合使用，使得豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠、快速、靈敏，檢測結(jié)果穩(wěn)定，不會出現(xiàn)誤差，而且檢測方法成本低廉，方法簡單，適于基層應(yīng)用，給豬的養(yǎng)殖及防病、抗病帶來了極大的便利。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明中所使用的方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的試劑及試劑盒，如無特殊說明，均為市售產(chǎn)品。

本發(fā)明檢測方法的總體思路是：對隨機抽取規(guī)模場的仔豬及育肥豬血清樣品，首先對采集的血清樣品進行IHA（間接血凝試驗）方法檢測，然后對采集的血清樣品進行APPELISA試驗復(fù)檢，統(tǒng)計實驗室檢測結(jié)果，分析確定豬傳染性胸膜肺炎的情況。

一、檢測前的準(zhǔn)備

1、豬血清材料采集地點：石家莊地區(qū)。