[發(fā)明專利]一種肌紅蛋白納米磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310234764.2
• 申請(qǐng)日: 2013-06-14
• 公開（公告）號(hào): CN103278651A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉萍;欒大偉;宋啟超;董婷婷;李克錦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 博奧賽斯（天津）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/531;G01N21/76
• 代理公司: 天津?yàn)I海科緯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 李莉華

1.一種肌紅蛋白納米磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

1）肌紅蛋白校準(zhǔn)品，濃度為0，5，25，100，250，1000ng/mL；

2）偶聯(lián)有鏈霉親和素的納米磁微粒懸浮液；

3）生物素標(biāo)記的肌紅蛋白抗體，所述抗體為單克隆抗體；

4）肌紅蛋白抗體酶結(jié)合物，所用抗體為單克隆抗體，與生物素標(biāo)記的肌紅蛋白抗體不為同一株，所用的酶為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶純度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；

5）肌紅蛋白質(zhì)控品；質(zhì)控品包括濃度8-12ng/mL的低值質(zhì)控品和400-600ng/mL的高值質(zhì)控品；

6）化學(xué)發(fā)光液A液和B液；A液為5mmol/L，pH8.6的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度0.7g/L魯米諾和終濃度0.165g/L對(duì)碘酚；B液為0.675g/L過氧化脲；

7）20倍濃縮洗液；

8）反應(yīng)管。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌紅蛋白納米磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的肌紅蛋白質(zhì)控品，低值質(zhì)控品優(yōu)選10ng/mL，高值質(zhì)控品優(yōu)選500ng/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌紅蛋白納米磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的納米磁微粒是表面包裹帶有氨基或羧基活性基團(tuán)的四氧化三鐵，粒徑10-50nm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌紅蛋白納米磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的反應(yīng)管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

5.一種制備所述權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）肌紅蛋白校準(zhǔn)品的配制：

將肌紅蛋白抗原用山羊血清配制成校準(zhǔn)品濃儲(chǔ)液，以企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)，將濃儲(chǔ)液用山羊血清稀釋至工作濃度，分別為0，5，25，100，250，1000ng/mL；

（2）肌紅蛋白質(zhì)控品的配制：

用山羊血清將上述濃儲(chǔ)液稀釋至10ng/mL和500ng/mL，將10ng/mL作為低值質(zhì)控，500ng/mL作為高值質(zhì)控；

（3）納米磁微粒-鏈霉親和素懸浮液的制備：

A、四氧化三鐵納米磁微粒制備

采用沉淀法制備四氧化三鐵納米磁微粒，具體制備方法如下：1）將FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O以摩爾比2：1加入到蒸餾水中，劇烈攪拌溶解；2）在氮?dú)猸h(huán)境下加0.5M氨水于上述鐵鹽溶液中，調(diào)pH9-10，反應(yīng)溫度65℃，反應(yīng)時(shí)間45min；3）反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水洗滌至中性，棄上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三鐵納米磁微粒；

B、納米磁珠表面羧基的偶聯(lián)

采用分散聚合法進(jìn)行偶聯(lián)，具體制備方法如下：取上述制備的納米磁微粒超聲分散在10%PEG8000溶液中，得磁流體溶液，向磁流體溶液中按體積比1：10加入無(wú)水乙醇，攪拌30min后，移入帶有攪拌器，冷凝管，氮?dú)馊肟诘娜i瓶中，加入交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺；在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，升溫至60±1℃，恒溫?cái)嚢?0min，之后依次加入過氧化苯甲酰，用量為磁流體用量的3%，攪拌速度約為500rpm，苯乙烯體積同磁流體溶液，丙烯酸體積為磁流體溶液的1/4，保持氮?dú)鈿饬?其余條件保持不變,反應(yīng)8-10h，所得產(chǎn)物靜置，用蒸餾水反復(fù)洗滌，再用鹽酸調(diào)節(jié)pH=1，浸泡24h，靜置；再用蒸餾水反復(fù)洗滌，除去未包覆的Fe₃O₄磁粉，把沉淀下來的產(chǎn)品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h，得到表面聯(lián)有羧基的納米磁微粒；

C、納米磁微粒-鏈霉親和素懸浮液的制備，配制1L，方法如下：

取100mL0.1M?MES緩沖液，加入10mg表面聯(lián)有羧基的納米磁微粒，室溫?cái)嚢?0min，之后加入3.5mg鏈霉親和素，然后加入8mg/mLEDC溶液，2-8℃反應(yīng)1h后，用0.01M?PBS緩沖液洗滌3次，最后用0.01M?PBS定溶至1L即可；

（4）生物素標(biāo)記的肌紅蛋白抗體的制備

取0.8mg肌紅蛋白抗體，用硼酸鹽緩沖液在2～8℃下透析1～3h；將透析后的抗體加入30ug生物素，同時(shí)加入二甲基亞砜，使二甲基亞砜最終濃度5-10%，緩慢振蕩，避光反應(yīng)3h；在上述溶液中加入250uL1M氯化銨溶液，常溫避光反應(yīng)30-60min；用0.01MPBS溶液在2～8℃下透析24h，期間換液2-4次；

（5）肌紅蛋白抗體酶結(jié)合物的制備

采用改良高碘酸鈉氧化法將肌紅蛋白抗體與辣根過氧化物酶進(jìn)行偶聯(lián)后，用酶稀釋液將其稀釋至工作濃度1:5000，并加入13%酶穩(wěn)定劑，儲(chǔ)存于2～8℃；

（6）20倍濃縮洗液的配制

20倍濃縮洗液包括58g/L磷酸氫二鈉，5.92g/L磷酸二氫鈉，180g/L?NaCl，10mL/LTween-20和2%Proclin300；

（7）化學(xué)發(fā)光液A液和B液的配制

A液為0.7g/L魯米諾，0.165g/L對(duì)碘酚，緩沖液為pH8.6的5mmol/L?Tris-HCl，避光保存；B液為0.675g/L過氧化脲，用工藝用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）組裝：將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2～8℃；

（9）對(duì)采用該方法制備的試劑盒進(jìn)行物理檢查，對(duì)準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。