[發明專利]利用vgb基因構建的抗貧氧高密度發酵納他霉素基因工程菌株及其應用

無效

• 申請號: 201310234364.1
• 申請日: 2013-06-14
• 公開（公告）號: CN103555755A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 劉飛;王紹花;朱希強;凌沛學
• 申請（專利權）人: 山東省生物藥物研究院
• 主分類號: C12N15/76
• 分類號: C12N15/76;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/62
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技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及利用透明顫菌血紅蛋白(vgb)基因構建重組褐黃孢鏈霉菌工程菌株，通過vgb基因的表達，改善納他霉素高密度發酵過程中重組褐黃孢鏈霉菌對氧的利用率，以提高納他霉素的產量。?

背景技術

納他霉素(Natamycin)是一種天然、廣譜、高效的多烯大環內脂類抗真菌劑。與其他抗菌成分相比，納他霉素對哺乳動物細胞的毒性極低，可以廣泛應用于由真菌引起的疾病，如納他霉素以懸浮劑、乳劑、軟膏和鞘狀藥片等劑型被用于抗皮膚和黏液膜的真菌感染。另外，納他霉素的溶解度低，可用于對食品表面的處理，延長食品的保質期，卻不影響食品的風味和口感。1982年6月，美國FDA(Food?and?drug?dministration)正式批準納他霉素可用作食品防腐劑，并被歸類為GRAS產品之列，成為目前國際上唯一的抗真菌微生物防腐劑。1997年我國衛生部正式批準納他霉素作為食品防腐劑。目前納他霉素已經在50多個國家被廣泛應用于乳制品、肉制品、發酵酒、飲料等食品的生產和保藏。?

隨著納他霉素在醫藥及食品行業的不斷開發，其需求量不斷增加。但由于目前納他霉素發酵水平偏低，導致生產成本很高，嚴重限制了其在各領域的應用。其中發酵過程中溶氧不足是導致納他霉素發酵水平低的重要原因。納他霉素的產生菌如褐黃孢鏈霉菌為好氧菌，隨著發酵時間延長，菌體密度迅速增加，耗氧量極大，發酵罐的各項物理參數不能滿足氧的供給，尤其是高密度的褐黃孢鏈霉菌菌絲體相互纏繞，使得局部溶氧濃度更低，結果菌體生長減慢，納他霉素合成關鍵酶表達量降低，直接導致納他霉素產量降低。因此，如何在發酵過程中提高納他霉素生產菌株在高密度條件下對氧的利用，對提高生產菌體密度和納他霉素的產量具重要意義。?

透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla?Hemoglobin，VHb)是一類研究最透徹、應用最廣泛的原核生物血紅蛋白。研究表明，VHb與氧結合可以形成氧合態，并以該方式介入細胞與氧有關的代謝途徑中的某些關鍵步驟或途徑分支點，從而改變限氧時細胞原有的代謝途徑。相同培養條件下，VHb的表達可加快細胞的生長速率，提高細胞呼吸強度，降低細胞的臨界氧濃度，在大幅度的溶氧變化中保持恒定的呼吸率，從而使其在低氧條件下仍具有一定生長優勢。目前對透明顫菌血紅蛋白基因的研究越來越深入，除大腸桿菌外，還在假單胞桿菌、歐文氏菌、霉菌和酵母等多種微生物中進行了研究，并成功地應用于工業生產中，提高淀粉酶、青霉素酞化酶、放線紫紅菌素及等多種生化產品的產量。?

綜上所述，VHb能夠從分子水平上增強vgb基因重組菌對氧的利用能力，因此能在貧氧條件下促進細胞生長和產物合成，從而大幅度提高發酵產物的產量。本發明將透明顫菌血紅蛋白基因vgb整合入褐黃孢鏈霉菌基因組中，通過VHb的表達，有效解決納他霉素發酵生產中的氧供求矛盾，大幅度提高納他霉素的產量，降低生產成本，增加經濟效益。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用vgb基因構建的抗貧氧高密度發酵納他霉素的基因工程菌。所構建的基因工程菌株中VHb的成功表達，保證了宿主菌在高密度發酵貧氧環境中的攝氧能力，維持了細胞在低氧情況下的代謝，從而改善了重組基因工程菌株高密度發酵產納他霉素過程中的氧氣供求問題，大大提高了基因工程菌株的發酵水平。?

本發明的目的還在于提供所述基因工程菌的構建方法。?

本發明的目的是通過以下措施達到的：通過PCR擴增得到vgb基因，將vgb基因插入相應載體，構建整合型重組質粒，然后利用接合轉移的方式轉化褐黃孢鏈霉菌，經抗生素抗性篩選獲得整合有vgb基因的重組工程菌株，通過搖瓶發酵實驗篩選獲得表達血紅蛋白(VHb)，并可直接用于高產納他霉素的重組菌。?

所述vgb基因的啟動子為其自身啟動子。?

所述重組質粒為pSET152-vgb。?

其中，質粒還包括構建重組質粒pSET152-vgb過程中的其他載體：p^BBR-MCS5-vgb和pSET152。其中p^BBR-MCS5-vgb含有vgb基因全序列及其啟動子；pSET152含有質粒轉移所需元件及噬菌體的整合酶和整合位點；重組質粒pSET152-vgb是以p^BBR-MCS5-vgb載體為模板，PCR擴增獲得vgb基因及其啟動子序列，經雙酶切后插入pSET152質粒中構建而成。?