[發明專利]利用重組畢赤酵母生產蛋白A的方法

無效

• 申請號: 201310232528.7
• 申請日: 2013-06-11
• 公開（公告）號: CN103333911A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 賈凌云;郝晶;任軍;徐麗
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12P21/02;C07K14/31;C07K1/18;C07K1/14;C12R1/84
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 梅洪玉

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及到一種利用重組畢赤酵母生產蛋白A的方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus?aureus?Protein?A,SPA)是某些種類的金黃色葡萄球菌的細胞壁結合蛋白，該蛋白是由丹麥科學家Klaus?Jensen于上個世紀五十年代研究金黃色葡萄球菌細胞壁結構時發現的。其基本結構由以下三部分構成，即信號肽，抗體結合功能區和細胞壁結合區。蛋白A的抗體結合功能區包含E、D、A、B、C五個同源單結構域，每個單結構域都能與免疫球蛋白G(IgG)單獨作用。該蛋白對IgG的結合主要是基于對IgG的Fc區特異性的結合能力。正是因為蛋白A與人類和其他哺乳動物的多種免疫球蛋白具有特異性結合能力，因此被廣泛用作免疫學試劑(與多種報告分子偶聯后用于組織化學、Western、ELISA等的抗體檢測)；與固相載體相連，用于抗體的分離純化；臨床上用于治療抗體相關性疾病的血液凈化吸附劑等。

由于蛋白A的用途廣泛，因此有很大的市場需求量。蛋白A在研究之初是從金黃色葡萄球菌中直接提取的天然蛋白，該種獲取蛋白A的方法存在著很多弊端。首先，蛋白A只占金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白的6.7%，并且該蛋白為細胞壁結合蛋白，通過胞壁肽聚糖以共價鍵與細胞壁結合，分離純化過程需要通過酶解消化使蛋白A與細胞壁分離，造成了蛋白Ａ提取的復雜性增高；其次，金黃色葡萄球菌為致病菌，大規模生產危險性較大。而且蛋白Ａ廣泛用于抗體類藥物的制備和血液凈化，如果分離純化過程中產生病原菌物質的殘留，則會在人體內產生嚴重的免疫反應。因此近年來，人們開始轉向采用基因工程的方法來生產重組蛋白A，尋求大規模生產蛋白A安全有效的方法。

目前，蛋白A的表達主要是利用大腸桿菌表達系統。大腸桿菌因其具有構建相對簡單，生長周期短，易于培養等優點，成為研究相對成熟的表達宿主。蛋白A于八十年代被首次克隆并于大腸桿菌中表達。美國Repligen公司于1982年申請了關于利用大腸桿菌表達系統表達重組蛋白A的專利(US5151350)，采用金黃色葡萄球菌蛋白A的原序列，將其構建到載體pAc37中，表達宿主采用的是E.coli?MS371。其后，該公司又申報了名為“Nucleic?acids?encoding?recombinant?protein?A”的專利(US7691608)，涉及到的重組蛋白A帶有一部分細胞壁結合域(X)和全部功能區。Donald?Colbert等(Donald?Colbert,AlgisAnilionis,Pal?Gelep,et?al.Molecular?organization?of?the?protein?A?gene?and?its?expression?in?recombinant?host?organisms.J?BiolRespModif.1984.3:255‐259.)分別利用大腸桿菌MS371和酵母LL20表達重組蛋白A。但均為胞內表達，沒有表達量的測定和培養條件的優化。國內申報的專利有6項，均采用了蛋白A單結構域反復串聯，然后在重組大腸桿菌中進行表達(CN1432578A，CN1524957A，CN101050464A，CN101298476A，CN101298475A，CN101337986A)。

細胞內蛋白種類多，數量大，給重組蛋白A的分離純化帶來困難。基因工程產品的分離純化成本往往占產品總成本的60‐70%，并且分離純化的產品純度直接關系到最終產品質量，因此利于分離純化的表達體系是降低生產成本，提高產品質量的關鍵。

對于蛋白A的純化工藝，目前應用較多的主要有一步親和層析法和多步純化法。前者主要應用于實驗室規模，后者主要是基于Repligen公司所申請的相關專利內容，被應用于多數大規模生產當中。

由于蛋白A可與IgG分子相互作用，所以早期的蛋白A純化途徑就是利用IgG親和層析的方法。該方法早在1972年即被提出，1982年Repligen公司所生產的rSPA也是利用此種方法進行純化，目前國內的多數相關報道也是利用IgG親和純化的方法。IgG親和層析僅需一步操作便可使SPA純度達95%以上，操作簡便。但是，IgG作為生物大分子，穩定性差，清洗過程中易從載體上脫落對產品造成污染，同時也降低了層析柱的循環使用效率和使用壽命，增加了生產成本。IgG分子空間位阻大，單位載體偶聯配基密度低，加之偶聯過程中蛋白固定化的空間取向不一致，進一步增加空間位阻，大大降低了層析柱動態載量，難以大規模應用。