[發(fā)明專利]利用重組畢赤酵母生產(chǎn)蛋白A的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310232528.7
• 申請(qǐng)日: 2013-06-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103333911A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈凌云;郝晶;任軍;徐麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12P21/02;C07K14/31;C07K1/18;C07K1/14;C12R1/84
• 代理公司: 大連理工大學(xué)專利中心 21200
• 代理人: 梅洪玉

1.一種利用重組畢赤酵母生產(chǎn)蛋白A的方法，其特征是：通過(guò)分泌型表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K將蛋白A抗體結(jié)合功能區(qū)基因整合入畢赤酵母GS115基因組中，制備了可外泌表達(dá)蛋白A的重組畢赤酵母rGS115-spa，并篩選得到了高表達(dá)量的菌株；利用經(jīng)過(guò)優(yōu)化的BMGY/BMMY和BSM培養(yǎng)基，以甲醇為誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)方法實(shí)現(xiàn)了重組蛋白A的高密度發(fā)酵分泌表達(dá)；并利用脫鹽柱偶聯(lián)離子交換層析柱的方法對(duì)所得的含有蛋白A的發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，獲得純度接近色譜純，后收率約為80%的蛋白A產(chǎn)物。?

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于，?

（1）重組畢赤酵母的構(gòu)建及篩選方法：通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)設(shè)計(jì)引物，上游引物（spa-a）：5’GCTGCAGAATTCGCGCAACACGATGAAG3’；下游引物（spa-b）：5’AGGTTTGTTGGCGGCCGCTTATTTTGGT3’，在蛋白A抗體結(jié)合功能區(qū)基因兩端引入識(shí)別序列分別為為GAATTC和GCGGCCGC的EcoR?I和Not?I酶切位點(diǎn)，經(jīng)雙酶切后再連接插入pPIC9K中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pPIC9K-spa；重組質(zhì)粒經(jīng)制性內(nèi)切酶Sac?I將重組質(zhì)粒線性化后，利用電擊法轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115；轉(zhuǎn)化后的克隆經(jīng)RDB或MD平板篩選和菌液PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆再經(jīng)蛋白A表達(dá)量篩選，最終獲得高表達(dá)量的重組菌株rGS115-spa；?

（2）重組畢赤酵母生產(chǎn)蛋白A的誘導(dǎo)培養(yǎng)和發(fā)酵?

利用（1）得到的重組酵母生產(chǎn)蛋白A的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法：先利用BMGY培養(yǎng)基，在28℃-30℃，150-300rpm，pH6.0的條件下培養(yǎng)菌體至OD_600nm為2-6；再將菌體轉(zhuǎn)移至5-20倍體積的BMMY培養(yǎng)基中，在22℃-30℃，150-300rpm，pH2.6-5.6的條件下，每24小時(shí)補(bǔ)加甲醇至終濃度0.5%-2%，繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)。?

3.利用所述的重組酵母生產(chǎn)蛋白A的發(fā)酵方法為：先利用YEPD培養(yǎng)基在30℃，150-300rpm，pH6.0的條件下培養(yǎng)菌體至OD_600nm為4-8后轉(zhuǎn)接到BSM培養(yǎng)基中，在30℃，pH5.0的條件繼續(xù)培養(yǎng)下培養(yǎng)至BSM培養(yǎng)基中甘油消耗完全；再向BSM培養(yǎng)基中進(jìn)行甘油流加補(bǔ)料，繼續(xù)培養(yǎng)至OD_600nm為300-350；待培養(yǎng)基中甘油消耗完全后換成甲醇流加補(bǔ)料，誘導(dǎo)表達(dá)120h。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，利用所述的重組酵母生產(chǎn)蛋白A的純化方法為：先利用脫鹽柱去除發(fā)酵液中的色素和鹽等小分子物質(zhì)，再利用離子交換層析法對(duì)蛋白A進(jìn)行精細(xì)分離純化，使其最終純度達(dá)色譜純標(biāo)準(zhǔn)。?