[發明專利]一株失活乙酰乳酸合成酶的工程菌及其在生產1,3-丙二醇中的應用

無效

• 申請號: 201310230847.4
• 申請日: 2013-06-09
• 公開（公告）號: CN103305543A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 周勝;秦啟偉;李莉莉;黃友華;高任
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/03;C12N1/21;C12P7/18;C12R1/22;C12R1/19
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一株失活乙酰乳酸合成酶的工程菌及其構建方法和在生產1,3-丙二醇中的應用。

背景技術：

1,3-丙二醇（PDO）是一種重要的化工原料。PDO可作為有機溶劑，應用于耐壓高潤滑劑、染料、油墨、防凍劑等行業；也可用來合成雜環、藥物中間體、聚酯和聚氨酯；其中最主要的用途是作為單體合成聚對苯二甲酸丙二醇酯（PTT）。PTT是繼50年代聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）、70年代聚對苯二甲酸丁二醇酯（PBT）之后實現工業規模的新的可成纖聚酯高分子材料，是一種極有發展前途的新型聚酯材料。1998年PTT被美國評為六大石化新產品之一。PTT與PET、PBT相比除具有聚酯的耐化學性外，還具有其它一些更優良的特性。如尼龍的彈性、恢復性；在全范圍無需添加特殊化學藥品即能呈現良好的連續印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的著色性；抗內應力；低水吸附、低靜電以及良好的可生物降解性；可循還利用性等。由于PTT的優良特性，它在地毯工業、服裝材料、工程熱塑料以及其它眾多領域有著很廣泛的應用。

生產PTT纖維的關鍵在于單體原料PDO的來源。PTT占領市場的關鍵在于價格，而PTT的價格主要取決于PDO的價格。由于不能廉價制得PDO，制約了PTT的生產和市場開拓；直到90年代中期實現了工業化生產PDO，使得PDO價格大大降低，PTT才開始工業化生產和應用。

Dupont和Shell兩家跨國公司曾采用化學合成路線，以環氧乙烷或丙烯為原料生產PDO。化學合成法生產PDO的缺點是選擇性和產率較低，操作條件需要高溫高壓，設備投資巨大，原料不可再生；由于產量有限，長期以來PDO售價偏高。

生物法生產1,3-丙二醇主要是微生物發酵。與化學合成法相比，微生物發酵法生產1,3-丙二醇具有顯著的優點：1、利用成本較低的可再生資源（如甘油、玉米、淀粉）為原料；2、生產條件溫和，操作簡便，不需貴重金屬催化劑；3、選擇性好，副產物較少，易于分離純化；4、環境污染小。微生物發酵法是以生物技術為特征的“綠色工業”向傳統石油化工提出的強有力的挑戰，具有重要的現實意義，因而越來越受到重視。

微生物發酵法生產1,3-丙二醇是利用微生物歧化甘油產生。至今所有被發現的1,3-丙二醇生產菌種均為細菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiella?pneumoniae)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter?freudii)和丁酸梭菌(Clostridium?butyricum)具有較高的1,3-丙二醇轉化率和1,3-丙二醇生產強度，具有較高的開發前景，從而得到了較多關注。

目前被用來生產1,3-丙二醇的克雷伯氏菌主要分離自土壤環境中。克雷伯氏菌只能利用甘油合生1,3-丙二醇。在合成1,3-丙二醇的過程中，甘油發生岐化反應，氧化途徑中的產物與糖類發酵產物一致，并產生供細胞生長所必需的ATP，在某些產物形成的同時釋放還原力NADH；還原途徑則消耗氧化途徑中多余的還原力，生成1,3-丙二醇。氧化途徑中甘油先被氧化生成丙酮酸；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解為乙酰CoA和甲酸，甲酸往往又會分解為CO₂和H₂。乙酰CoA在經乙酰磷酸形成乙酸的過程中生成過量的ATP，而在經乙醛形成乙醇的反應中要消耗2摩爾還原力；丙酮酸也可能轉化為2,3-丁二醇,乳酸和琥珀酸，生成乳酸的過程要消耗1摩爾還原力。而生成琥珀酸的過程要消耗2摩爾還原力。還原途徑包括兩步反應：第一步，由依賴于輔酶B₁₂的甘油脫水酶催化甘油脫水生成3-羥基丙醛；第二步，由1,3-丙二醇氧化還原酶催化3-羥基丙醛還原生成1,3-丙二醇，此過程消耗1摩爾還原力。