[發明專利]一種檢測小分子多肽類藥物組織分布的方法

無效

• 申請號: 201310229591.5
• 申請日: 2013-06-08
• 公開（公告）號: CN103336128A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 蔡永明;張宗鵬;申文晉;宋紫輝;李春雨;王海榮;項宗尚;張春云
• 申請（專利權）人: 天津藥物研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/534;G01N33/535
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技術領域

本發明屬于生命科學技術領域，涉及一種檢測小分子多肽類藥物組織分布的方法，具體來說，涉及一種將細胞裂解液提取、液氮凍存和免疫學分析測定技術相結合檢測小分子多肽類藥物組織分布的方法。

背景技術

近年來隨著基因組學、蛋白組學及生物技術的發展，各種與內源性活性蛋白或肽類物質結構、功能相似或功能獨特的小分子多肽類藥物不斷涌現，涉及疾病的預防、診斷和治療等各方面，尤其在癌癥、自身免疫性疾病、代謝類疾病治療等諸多領域具有顯著的療效。與傳統的小分子化學藥物相比，小分子多肽類藥物具有生物活性強、用藥量小等優點，但基于分子結構特點，亦具有穩定性差，易被體內蛋白酶降解，半衰期短，擴散性差，分配系數小等不足。將小分子多肽類藥物與新型釋藥系統如微球、微囊、納米粒、脂質體、乳劑等相結合是當今的研究熱點。既解決了小分子多肽類藥物半衰期短、需要長期頻繁注射給藥、結構不穩定、體內滲透性差等引起的體內系統遞送技術難點，也可以利用給藥載體實現針對特定組織和器官釋放藥物的靶向性及緩釋性。

研究小分子多肽類藥物的組織分布，即監測給予藥物后不同時間藥物在多種組織中的分布狀況具有重大意義。在藥效學研究方面，可了解藥物在體內的作用部位，為探索可能的靶器官、靶組織和作用機理提供依據；在毒理學研究方面，可了解藥物過量給予后在體內的蓄積程度和毒性靶器官、靶組織，預測可能出現的毒性反應，為闡釋藥物在重復給藥毒性研究中所產生毒性反應的中毒靶器官提供依據。尤其對于靶向作用的藥物，進行組織分布研究還有助于評價和檢驗其制劑工藝、水平和作用的靶向性。

目前，針對化學藥物和大分子蛋白的組織分布研究開展較多，方法亦相對成熟，而針對小分子多肽類藥物的組織分布檢測，目前尚無較為成熟和普適性強的方法。由于小分子多肽類藥物穩定性差，易被體內蛋白酶降解，且免疫原性低，因此對組織提取液的制備方法具有較高的要求。基于藥物特點，方法應保證在保留原有生物學活性或免疫學活性的基礎上最大限度提取組織中的藥物，以滿足定量測定組織中藥物含量的要求。

針對小分子多肽類藥物生物活性高，給藥劑量小，血藥濃度低，內源性物質干擾等技術難點，如何建立靈敏、特異、快速簡便的定量檢測多種組織、器官中藥物濃度的方法也是小分子多肽類藥物組織分布研究的難點所在。免疫學分析（放射免疫和酶聯免疫）測定技術是小分子多肽類藥物生物樣品分析的主要手段之一，具有靈敏、快速、適合于批量處理等特點。其基本原理是基于藥物與相應抗體結合時具有專一性和飽和性的特點，利用被測藥物與酶或放射性同位素標記藥物之間競爭性的與抗體結合，以及被測藥物與酶標記抗體特異性結合等原理，采用放射性同位素計數法或比色法等手段的定量測定技術。因此，免疫學分析技術是研究小分子多肽類藥物組織靶向分布較為適宜的方法。

發明內容

涉及一種檢測小分子多肽類藥物組織分布的方法，具體來說，涉及一種將細胞裂解液提取、液氮凍存和免疫學分析測定技術相結合檢測小分子多肽類藥物組織分布的方法。

因此，本發明的目的是提供一種檢測小分子多肽類藥物組織分布的方法，該方法將細胞裂解液提取、液氮凍存和免疫學分析測定技術有機結合，成功地運用到檢測小分子多肽類藥物組織分布中。實驗表明，這種以細胞裂解液提取、液氮凍存為關鍵技術的組織提取液制備方法，以免疫學測定技術為主要定量手段的檢測小分子多肽類藥物組織分布的方法，能夠成功地應用于檢測注射用醋酸曲普瑞林微球等小分子多肽類藥物的組織分布中。

本發明提供的用于測定小分子多肽類藥物組織分布的方法包括以下步驟：

1.組織提取液制備：實驗動物于給藥前或給藥后特定時間點實施安樂死，根據被測藥物的藥理活性和作用機制，選取動物的多種組織/臟器，如心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、胸腺、肌肉、腦、脂肪、卵巢、子宮、睪丸、前列腺等，用冰浴0.9%生理鹽水沖洗組織表面殘血后，用濾紙吸干水分，稱重，放液氮中凍存2小時。取出后加入一定比例細胞裂解液裂解，在冰浴下勻漿，離心，取上清液，冷凍保存待測。

2.免疫學測定技術：根據被測藥物的性質，可以采用放射免疫分析（RIA）法或酶聯免疫分析（ELISA）法。

RIA法：

（1）采用放射性同位素標記小分子多肽；放射性同位素選自¹²⁵I、99mTc、³H、¹⁴C或³⁵S，優選為¹²⁵I，標記方法為氯胺T法或Iodogen法。分離純化標記抗原后，考察其放射化學純度、放射性活度、生物活性和免疫活性等。