[發明專利]一種用于糖基分離的微流控凝集素芯片及其制備方法

有效

• 申請號: 201310229106.4
• 申請日: 2013-06-08
• 公開（公告）號: CN103344464A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 孫東平;陳春濤;聶英;朱春林;黃洋;楊加志
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;B01L3/00
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 朱顯國

技術領域

本發明涉及流控芯片領域，特別是一種基于玻璃材質、細菌纖維素基質填料、應用于糖基化合物和微生物分離檢測的凝集素芯片及其制備方法。

背景技術

凝集素芯片是糖組學研究的一項新技術，屬于微流控芯片中分析芯片的一種。結構糖組學的研究主要聚焦在質譜技術和前沿親和層析技術，但是質譜在區分糖異質體時仍然存在困難，而且對粗提樣本的應用存在限制,通過凝集素親和技術提取樣本的核心糖譜信息，能以高通量的方式提供糖結構信息，因此，凝集素芯片可以作為質譜技術的互補技術，用于區分糖異質體和對粗提樣本的識別。蛋白質的糖基化在許多生物過程，如免疫、細胞識別、信號傳導以及病毒侵入等發揮著重要的作用。

糖蛋白上的糖鏈在很大程度上影響著蛋白質的結構和功能。因此蛋白質糖基化的分析不論是在蛋白質組學的研究還是在藥物篩選中都具有重要的意義。應用固定有凝集素的微流控芯片對糖蛋白進行分離分析具有重大的使用價值。微生物表面含有糖蛋白，但微生物發生病變或者其它改變，其糖蛋白的種類或是數目會有改變，表現在凝集素芯片上就是對凝集素親和作用的強弱會發生明顯變化。所以可以通過觀測微生物表面糖蛋白的改變情況來進行微生物代謝狀況預測。

毛秀麗等在Anal.?Chem.,76,2004,分別以寡糖鏈、糖肽以及整個糖蛋白（糖形）為分析對象，進行以微流控芯片和質譜或者二者聯用為基礎的?N-連接蛋白質糖基化分析平臺和方法的研究。在微流控芯片上實現了簡單糖的快速電泳分離和直接、間接激光誘導熒光檢測；發展了以芯片電泳與外切糖苷酶酶解結合，激光誘導熒光檢測為基礎，以糖肽為分析對象的糖鏈結構類型分析方法，對火雞卵白蛋白的糖鏈結構進行推測，結果表明該蛋白含有高甘露糖型和雜合型的糖鏈；設計并制備了一種集成化凝集素親和微流控芯片。該芯片采用電泳的方法，以電滲流為推動力，在需要保持活性的物質研究方面會有較大的局限性。Jolita等在J.Chromatogr.B,831,2006,以改性纖維素作為基質，采用五乙烯六胺作為懸臂分別接枝了兩種凝集素來制作了凝集素親和色譜柱，該色譜柱在分離糖基化合物是表現出了較高的重現性，但該方法操作步驟相對繁瑣。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于糖基分離的微流控凝集素芯片及其制備方法。

實現本發明目的的技術解決方案為：一種用于糖基分離的微流控凝集素芯片，包括微型柱通道，樣品通道，樣品入口，填料入口，柱前監測點，微型柱，填料出口，柱后監測點，樣品出口，玻璃蓋片，玻璃基底，聚四氟乙烯管；其中微型柱通道包括微型柱通道前部、微型柱、微型柱通道后部，樣品通道包括樣品通道前部、微型柱、樣品通道后部，且微型柱通道與樣品通道于微型柱處重疊，其中樣品通道前部、微型柱、樣品通道后部位于同一水平線上，微型柱通道前部與微型柱通道后部分別位于樣品通道上下兩側，微型柱通道前部與樣品通道前部的角度為α，微型柱通道后部與樣品通道后部的角度為β；微型柱通道前端設有填料入口，微型柱通道末端設有填料出口，樣品通道前端設有樣品入口，樣品通道末端設有樣品出口，所述填料入口、填料出口、樣品入口、樣品出口分別與一根聚四氟乙烯管固定；樣品通道前部設有柱前監測點，樣品通道后部設有柱后監測點；所述微型柱通道與樣品通道刻蝕于玻璃蓋片，玻璃蓋片與玻璃基底高溫鍵合。

一種用于糖基分離的微流控凝集素芯片的制備方法，包括如下步驟：

步驟一，繪制通道圖形，將設計好的通道圖形打印在膠片上制成掩膜。?

步驟二，采用紫外刻蝕的方法將掩模板上的圖形轉移到玻璃蓋片上。

步驟三，將經過刻蝕后的玻璃蓋片在超聲波打孔機下于通道末端位置打孔，形成通道出入口；打孔后的玻璃經過清洗后置于濃硫酸中活化，在馬弗爐中程序升溫與玻璃基底高溫鍵合，冷卻后酸洗。

步驟四，將細菌纖維素進行堿化處理，離心浸泡中和干凈，粉碎，過篩，乙醇活化干燥后于溶劑中溶解，封閉樣品入口和樣品出口，然后將溶解后的細菌纖維素由填料入口注入微型柱的位置，冷凍干燥使再生細菌纖維素蓬松將柱子填滿，清洗干凈。

步驟五，向樣品入口和樣品出口中注溶解后的高取代羥丙基纖維素進行通道改性，過夜室溫放置后洗干凈。

步驟六，選定凝集素，封閉填料入口和填料出口，調節環氧氯丙烷pH，再將環氧氯丙烷于樣品入口通入通道中，放置，然后在凝集素等電點條件下，將凝集素溶于TBS緩沖液后于樣品入口通入通道中。

步驟七，封閉填料入口和填料出口，將糖基物質溶解于磷酸緩沖溶液，并于樣品入口中通入芯片進行分離，后將光譜掃描儀置于芯片檢測點上方進行在線檢測。