[發明專利]基于切刻內切酶恒溫擴增技術的ATP或NAD的系統及檢測方法

無效

• 申請號: 201310228082.0
• 申請日: 2013-06-08
• 公開（公告）號: CN103276096A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 馬昌杯;夏昆;陳漢春;何海倫
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/25
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明涉及到生物化學領域中的檢測方法，具體涉及ATP與NAD檢測系統和方法。

背景技術

三磷酸腺苷（ATP）存在于從微生物到高等動植物等生物體的細胞中，主要作用是提供能量，參與體內脂肪、蛋白質、糖和核酸的代謝，是機體能量的重要能源，在維持生物體的正常機能上有著無可替代的作用；ATP含量的多少，可以直接反映細胞活性，細胞死亡后由于細胞內有ATP酶的存在，ATP迅速水解，因此測定內源性ATP的含量可以反映活細胞的數量；在體外測定經不同濃度化療藥物直接殺傷的培養腫瘤細胞中的ATP含量，即可判斷該腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度。在環境分析方面，ATP含量的多少還可反映微生物的數量即污泥活性，檢測微生物代謝產生的ATP已經成為化妝品、食品、藥品等許多行業中生產商關注的焦點；另外細胞內的ATP還可作為上皮細胞的一個信號分子，在細胞死亡模式（凋亡或壞死）的辨別過程中起著非常重要的作用。傳統上，ATP的檢測方法有電泳法、高效液相色譜法、同位素示蹤法和熒光素法等。在電泳法測定中，樣品需經濾紙電泳分離，再利用紫外分光光度計進行比色，操作復雜，靈敏度也不夠高；采用高效液相色譜法，儀器、試劑昂貴，操作過程繁瑣；同位素示蹤法中放射性同位素對人體有危害；熒光素法靈敏度較高，但同時存在首期投入大（需要購買相關儀器）以及操作和結果分析較傳統的平板培養法復雜等缺點。

NAD作為目前已知的300多種脫氫酶的輔酶，存在于一切動物、植物和微生物的細胞中，是生物發酵、生命和生理過程參與能量代謝的一種重要物質。目前NAD、NADH的檢測包括其相關酶的分析方法大都利用一些酶將NAD轉化為NADH，然后利用NADH在360nm紫外光區有最大吸收建立了其紫外吸收光度法或利用NADH的熒光進行直接熒光測定，還有電化學方法、高效毛細管電泳法及高效毛細管電泳-電化學方法聯用，但是文獻報道的方法NAD的檢測限一般僅為10^-7M-10^-8M，最近報道發展了NAD（H）流動注射分析方法，檢測限才達1pmol，上述方法的檢測線性范圍一般在兩個數量級左右。上述方法靈敏度不夠，使得對微小體系及極微量體系的分析受到了限制；同時容易受其它物質的干擾，不利于生物活體分析。

因此，建立快速、靈敏和準確的ATP與NAD分析方法不僅有助于推動生命過程的研究，同時對于臨床診斷、藥物分析等領域也有著重要的實際意義。

發明內容

本發明旨在發展一種快速高靈敏的ATP或NAD的檢測系統和方法，以解決當前分析方法存在的靈敏度不高及操作復雜等問題。為它們的分析及應用提供了一種全新的途徑。

基于切刻內切酶恒溫擴增技術的ATP或NAD的系統，該系統由尾部一端帶有熒光標記、另一端帶有熒光標記或者熒光熄滅基團的分子信標核酸探針，與分子信標環部配對的兩個核酸片段、DNA或RNA核酸連接酶、以及切刻內切酶在緩沖溶液中組成。

檢測ATP的體系配制如下：在含有66mM?pH8.0的Tris-HCl、6.6mM?MgCl₂和10mM?DTT的100μL反應緩沖液中加入300nM分子信標5'-(TAMRA)–CCTCTC?TGA?GTG?CAT?TCC?AGT?ACG?GAGAGG-(DABCYL)（DABCYL：熒光熄滅基團4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸）-3'、1.4U的T4DNA連接酶，4U的Nb.Bsm?I切刻內切酶,200nM核酸片段5'-ATG?CAC?TC-3'和200nM另一核酸片段5'-CGT?ACT?GGA-3'；

檢測NAD的體系配制如下：在含有30mM?pH8.0Tris-HCl、2.5mM?CaCl₂、5mM?DTT、10mM?MgCl₂、1.2mM?EDTA和0.05﹪BSA的100μL反應緩沖液中加入300nM分子信標5'-(TAMRA)–CCTCTC?TGA?GTG?CAT?TCC?AGT?ACG?GAGAGG-(DABCYL)-3'、6.0U的E.coli?DNA連接酶，4U的Nb.Bsm?I切刻內切酶，200nM核酸片段5'-ATG?CAC?TC-3'和200nM另一核酸片段5'-CGT?ACT?GGA-3'。

采用所述的系統檢測ATP或NAD的方法：

將緩沖體系在37℃溫育，同時監測熒光強度，待熒光穩定后加入ATP或NAD樣品，觀察并記錄熒光強度的變化。