[發(fā)明專利]一種綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶、其編碼序列、載體、菌株及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310227703.3
• 申請(qǐng)日: 2013-06-07
• 公開（公告）號(hào): CN103275999A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚永安;肖留斌;柏立新;孫洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/56
• 分類號(hào): C12N15/56;C12N9/24;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶、其編碼序列、載體、菌株及應(yīng)用。

背景技術(shù)

綠盲蝽Apolygus?lucorum(Hemiptera:Miridae)屬半翅目盲蝽科，是棉花、蔬菜、果樹、牧草等多種農(nóng)作物上的重要害蟲。近年來(lái)，由于轉(zhuǎn)Bt基因棉的大面積種植和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整等原因，綠盲蝽種群數(shù)量急劇上升，加之長(zhǎng)期依賴化學(xué)農(nóng)藥防治，致使綠盲蝽的抗藥性日漸增強(qiáng)，目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的綠盲蝽防控面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，急待開拓減少化學(xué)農(nóng)藥使用的新型無(wú)公害防控手段。

綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶(membrane-bound?trehalase，ALTre-2)是其體內(nèi)的重要酶系，它是一種跨膜蛋白，主要水解食物中的海藻糖，在飛行、肌肉運(yùn)動(dòng)和取食階段中腸等生理活動(dòng)中發(fā)揮作用，同時(shí)ALTre-2也影響昆蟲中腸幾丁質(zhì)的合成，因此，膜結(jié)合型海藻糖酶已成為害蟲控制的重要靶標(biāo)。

運(yùn)用昆蟲海藻糖酶抑制劑防治昆蟲是一種害蟲防控新興方法，然而目前從體外獲得的重組海藻糖酶十分缺乏，同時(shí)對(duì)于綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)研究。因此分離純化綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶，研究其生化特征，這對(duì)于進(jìn)一步開發(fā)其抑制劑有著重要的理論意義和指導(dǎo)作用。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于編碼綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶的DNA序列，如SEQ?ID?NO：1所示。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于編碼綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶的DNA序列的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供所述的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌在生產(chǎn)綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶中的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一目的是提供一種綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶的制備方法。

技術(shù)方案：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種用于編碼綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶的DNA序列，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示。

一種綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

含有所述的用于編碼綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶的DNA序列的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌。

所述的重組表達(dá)載體，將所述的DNA序列插入到大腸桿菌表達(dá)載體中得到的表達(dá)綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶的重組表達(dá)載體。

所述的重組表達(dá)載體，所述大腸桿菌表達(dá)載體為PET28a。

所述的轉(zhuǎn)基因重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，篩選得到轉(zhuǎn)基因重組菌。

所述的大腸桿菌為BL21（DE3）。

所述的DNA序列、所述的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌在生產(chǎn)綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶中的應(yīng)用。

一種綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶的制備方法，是培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)基因重組菌得到的綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶。

一種綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶（ALTre-2）的制備方法，包括以下步驟：

1、綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶基因的擴(kuò)增；

2、綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶基因原核表達(dá)載體構(gòu)建；

3、綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶蛋白的變性和復(fù)性；

4、綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶蛋白的純化即得到綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶。

有益效果：本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1．本發(fā)明的綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶由519個(gè)氨基酸組成，是目前報(bào)道分子量較小的海藻糖分解酶，小分子的酶蛋白可具有更高的比活，比大分子量的酶更加容易實(shí)現(xiàn)工程菌的高效表達(dá)，容易降低酶的生產(chǎn)成本。本發(fā)明制得的酶蛋白分子量為60KD，最佳pH值為7.0，最佳溫度為50℃，可降解海藻糖成為葡萄糖。純化出的海藻糖酶可以用于工業(yè)及其它一些領(lǐng)域海藻糖含量的定性及定量工作，同時(shí)可為昆蟲海藻糖酶抑制劑的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

2．本發(fā)明的綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶的適合反應(yīng)溫度范圍廣，在25～60℃都能保持較高的酶活力，在工藝中可以通過(guò)降低反應(yīng)溫度來(lái)提高海藻糖的分解率，也可以通過(guò)提高反應(yīng)溫度來(lái)加快反應(yīng)速度。

附圖說(shuō)明