[發明專利]多重PCR檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201310227525.4
• 申請日: 2013-06-08
• 公開（公告）號: CN103276094A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 張建東;譚曉利
• 申請（專利權）人: 瀚吉康生物科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，尤其涉及多重PCR檢測方法及試劑盒。

背景技術

聚合酶鏈式反應（PCR）已被廣泛應用于醫學、遺傳學、微生物學乃至整個生命科學中。多重PCR是在常規PCR基礎上發展的一種新型擴增技術，即可在一個反應體系中加入兩對或以上引物，同時擴增多個核酸片斷。多重PCR在微生物、遺傳病、腫瘤、藥物基因組學等學科中有著重要的應用。

當前多重PCR檢測技術主要利用下列技術方法：1）多重擴增產生長度不同的擴增片段，PCR后利用瓊脂糖凝膠電泳或毛細管聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨出長度不同片段；2）多重擴增產生核酸序列不同的片段，利用不同波長熒光素標記的探針在實時熒光PCR儀的相應通道檢測；3）多重擴增產物與攜帶不同PCR產物互補鏈的顏色標記微珠雜交檢測。以上所訴方法各有優缺點。

利用凝膠電泳需要在PCR后打開PCR反應管，凝膠電泳，染色照相或讀取電泳圖等步驟。其最大缺點是擴增后的開管操作，易造成實驗室PCR產物污染。且操作繁雜，勞動強度大，實驗周期長，通量小。Luminex微珠法成本明顯高于其它兩種方法，且所需設備昂貴，普及程度較低。熒光探針法，如Taqman、Fret雜交探針等主要局限性于實時熒光PCR儀的通道數量有限，通常不超過6通道，因此限制了最高PCR擴增目標數量。

多重連接探針擴增技術（MLPA）法是一種多重核酸檢測的方法。它采用變化標簽序列長度的方法，其檢測依賴于分辨PCR擴增子的長度。MLPA需在PCR反應后打開反應管，之后利用毛細管電泳分辨擴增產物。具有設備昂貴，操作復雜，易污染等缺點。不適于在臨床分子檢測實驗室廣泛推廣。

臨床實驗室、疾病控制中心、進出口檢疫等部門迫切需要一種多重PCR檢測方法同時高效率檢測多種被檢物，如腫瘤突變基因、血源性微生物病原體、傳染性呼吸道微生物病原體、個性化藥物基因組學等。它需具有設備要求低、操作簡單、檢測周期短、不造成實驗室污染等特點。

發明內容

為了彌補以上領域的不足，本發明提供了一種多重PCR檢測方法及試劑盒。

本發明所提供的多重PCR檢測方法，包括以下步驟：

（1）根據靶標基因序列，分別設計上游引物、下游引物、共同引物和探針序列：

所述上游引物與靶標基因序列的上游序列相同；

所述下游引物由3'端特異結合區、外源標簽序列區和下游共同引物區三部分組成；所述3'端特異結合區與靶標基因序列特異雜交；所述外源標簽序列區與所述探針序列完全互補或含有限數目核苷酸錯配；所述下游共同引物區與所述共同引物序列相同；

所述共同引物的3'端標記熒光素；

所述探針序列與目的基因序列無顯著同源性，且3'端標記熒光素；

（2）配置多重PCR反應體系：所述多重PCR反應體系包括：Taq?DNA聚合酶、PCR緩沖液、Mg²⁺、dNTP、探針、上游引物、下游引物和共同引物，其中，上游引物與下游引物濃度相同，共同引物濃度為上游引物或下游引物濃度的10-20倍；

（3）進行PCR擴增，在PCR擴增周期結束后，進行熔解曲線分析；當探針與外源標簽序列完全匹配時，Tm值最高；Tm值隨著探針與外源標簽序列的錯配數目增多而降低。

所述外源標簽序列對應于特異的目的基因序列。

所述外源標簽序列區與所述探針序列含有限數目核苷酸錯配為所述外源標簽序列區與所述探針序列有1-3個堿基錯配。

所述共同引物的3'端標記熒光素為熒光素供者，所述探針的3'端標記熒光素為熒光素受者，所述熒光素供者與所述熒光素受者在相距小于3個堿基距離時發生能量共振轉移。

所述探針序列的長度為15-35個核苷酸堿基，Tm值為55℃-75℃。

所述上游引物的長度為15-30個核苷酸堿基；所述下游引物長度為45-80個核苷酸堿基。

本發明還提供了一種用于檢測人肌動蛋白的多重PCR試劑盒。

本發明所提供的多重PCR試劑盒，包含以下序列：

上游引物序列BA1FP：序列表中序列1；

下游引物序列BA1RP：序列表中序列2；

上游引物序列BA2FP：序列表中序列3；

下游引物序列BA2RP：序列表中序列4；

上游引物序列BA3FP：序列表中序列5；

下游引物序列BA3RP：序列表中序列6；