[發(fā)明專利]香魚假單胞菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310227164.3
• 申請(qǐng)日: 2013-06-06
• 公開（公告）號(hào): CN103276093A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王國(guó)良;張繼挺;劉順;周濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/38
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)菌的PCR檢測(cè)技術(shù)，具體涉及香魚假單胞菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

香魚假單胞菌（Pseudomonas?plecoglossicida）最早于上世紀(jì)90年代被報(bào)道為香魚的一種細(xì)菌，近年發(fā)現(xiàn)該菌同時(shí)對(duì)大黃魚也具有較強(qiáng)的致病性，該菌從感染、發(fā)病至死亡的延續(xù)流行時(shí)間長(zhǎng)，感染性強(qiáng)，死亡率高，危害性大，平均發(fā)病率高達(dá)30%，平均死亡率達(dá)60%以上。我們?cè)诤ＫB(yǎng)殖的各規(guī)格大黃魚中均發(fā)現(xiàn)了該病菌，由于該細(xì)菌宿于魚體內(nèi)臟（肝、脾、腎等），主要癥狀為內(nèi)臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)，而早期體表無明顯癥狀，給魚病檢測(cè)和防治帶來了困難。因此，建立香魚假單胞菌的檢測(cè)技術(shù)，尤其是早期快速檢測(cè)技術(shù)就顯得尤為重要和迫切。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種香魚假單胞菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒可以靈敏、快速、定量、特異性的檢測(cè)出早期的香魚假單胞菌。本發(fā)明還提供了用該檢測(cè)試劑盒檢測(cè)香魚假單胞菌的方法，為水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌檢測(cè)、養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測(cè)、養(yǎng)殖飼料細(xì)菌檢測(cè)等均具有重要意義。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：香魚假單胞菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，該試檢測(cè)劑盒包括SYBR?Premix?Ex?Taq^TMII（2×）試劑（購(gòu)于TaKaRa公司）10.0μl，濃度為10μmol/L（μM）的上游引物溶液和下游引物溶液各0.8μl，所述上游引物的核苷酸序列為：5，TATCCTCGGC?GAATATGACC3，，所述下游引物的核苷酸序列為：5，CTGCTTTCGG?ACTCTTCTTC3，。

用香魚假單胞菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)香魚假單胞菌的方法，包括下述步驟：

1）細(xì)菌提取：取1.5ml樣品液置于離心管中，在室溫下6000rpm離心2min，棄上清液，在沉淀中加無菌水至半管，在室溫下6000rpm，離心5min，棄上清液，再在沉淀中加無菌水至半管，在室溫下6000rpm離心5min，棄上清液，然后在沉淀中加TE緩沖液（TE?Buffer溶液）至半管，在室溫下6000rpm離心5min，棄上清液，得到細(xì)菌提取物，所述TE?Buffer溶液的pH8.0；TE?Buffer溶液購(gòu)于上海生工生物工程有限公司，也可以由濃度為10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液(Tris-HCl)與濃度為1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)自配成pH8.0的TE?Buffer溶液；

2）細(xì)菌酶解：在上述細(xì)菌提取物加入TE?Buffer溶液450μl和濃度為50mg/ml的溶菌酶20μl，置于37°C水浴中酶解24h，然后加入質(zhì)量百分濃度為20%的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液25μl，置于56°C水浴中酶解30min，再加入濃度為20mg/ml的蛋白酶K溶液5μl，置于37°C水浴中酶解1h，加入500μl飽和酚，輕輕上下顛倒混合均勻，在4°C下10000rpm離心15min，棄沉淀得到細(xì)菌酶解液；酶解的目的是：菌體破壁，釋放DNA，溶菌酶可以裂解細(xì)胞壁，蛋白酶K可以降解蛋白質(zhì)；溶菌酶和蛋白酶K購(gòu)于上海生工生物工程有限公司；

3）DNA粗提物制備：將上述細(xì)菌酶解液置于第一微量離心管中，加入細(xì)菌酶解液等體積的第一有機(jī)溶液，所述第一有機(jī)溶液由酚、氯仿和異戊醇按體積比25：24：1配置得到，上下顛倒混合均勻，在4°C下10000rpm離心10min，得到第一上清液，將第一上清液置于第二微量離心管中，加入第一上清液等體積的第二有機(jī)溶液，所述第二有機(jī)溶液由氯仿、異戊醇按體積比24：1配置得到，上下顛倒混合均勻，在4°C下10000rpm離心10min，得到第二上清液，將第二上清液置于第三微量離心管中，加入濃度為3mol/L的醋酸鈉（NaAC）溶液，所述醋酸鈉溶液與所述第二上清液的體積比1：10，再加入第二上清液二倍體積的-20°C無水乙醇，置于-20°C冰箱中培養(yǎng)，至大量絲狀DNA沉淀出現(xiàn)，然后以10000rpm離心10min，棄上清液，得到DNA沉淀，在DNA沉淀中加入質(zhì)量百分濃度為70%的乙醇至半管，在4°C下以12000rpm離心洗滌2min，棄上清液，再用70%的乙醇離心洗滌一次，然后將DNA沉淀在室溫下?lián)]干乙醇，得到DNA粗提物；這樣通過三級(jí)粗提可以去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；