[發明專利]香魚假單胞菌熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201310227164.3
• 申請日: 2013-06-06
• 公開（公告）號: CN103276093A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 王國良;張繼挺;劉順;周濤
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/38
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.香魚假單胞菌熒光定量PCR檢測試劑盒，該試檢測劑盒包括SYBR?Premix?Ex?Taq^TMII試劑10.0μl，濃度為10μmol/L的上游引物溶液和下游引物溶液各0.8μl，其特征在于所述上游引物的核苷酸序列為：TATCCTCGGC?GAATATGACC，所述下游引物的核苷酸序列為：CTGCTTTCGG?ACTCTTCTTC。

2.用權利要求1所述的香魚假單胞菌熒光定量PCR檢測試劑盒檢測香魚假單胞菌的方法，其特征在于步驟如下：

1）細菌提取：取1.5ml樣品液置于離心管中，在室溫下6000rpm離心2min，棄上清液，在沉淀中加無菌水至半管，在室溫下6000rpm，離心5min，棄上清液，再在沉淀中加無菌水至半管，在室溫下6000rpm離心5min，棄上清液，然后在沉淀中加TE緩沖液至半管，在室溫下6000rpm離心5min，棄上清液，得到細菌提取物，所述TE緩沖液的pH8.0；

2）細菌酶解：在上述細菌提取物加入TE緩沖液450μl和濃度為50mg/ml的溶菌酶20μl，置于37°C水浴中酶解24h，然后加入質量百分濃度為20%的十二烷基硫酸鈉溶液25μl，置于56°C水浴中酶解30min，再加入濃度為20mg/ml的蛋白酶K溶液5μl，置于37°C水浴中酶解1h，加入500μl飽和酚，輕輕上下顛倒混合均勻，在4°C下10000rpm離心15min，棄沉淀得到細菌酶解液；

3）DNA粗提物制備：將上述細菌酶解液置于第一微量離心管中，加入細菌酶解液等體積的第一有機溶液，上下顛倒混合均勻，在4°C下10000rpm離心10min，得到第一上清液，所述第一有機溶液由酚、氯仿和異戊醇按體積比25：24：1配置得到，將第一上清液置于第二微量離心管中，加入第一上清液等體積的第二有機溶液，上下顛倒混合均勻，在4°C下10000rpm離心10min，得到第二上清液，所述第二有機溶液由氯仿、異戊醇按體積比24：1配置得到，將第二上清液置于第三微量離心管中，加入濃度為3mol/L的醋酸鈉溶液，所述醋酸鈉溶液與所述第二上清液的體積比1：10，再加入第二上清液二倍體積的-20°C無水乙醇，置于-20°C冰箱中培養，至大量絲狀DNA沉淀出現，然后以10000rpm離心10min，棄上清液，得到DNA沉淀，在DNA沉淀中加入質量百分濃度為70%的乙醇至半管，在4°C下以12000rpm離心洗滌2min，棄上清液，再用70%的乙醇離心洗滌一次，然后將DNA沉淀在室溫下揮干乙醇，得到DNA粗提物；

4）DNA粗提物純化：在上述DNA粗提物中加入TE緩沖液400μl和濃度為10mg/ml的RNA酶溶液5μl，37°C下溫育1h，再加入上述第一有機溶液5μl，上下顛倒混合均勻，在4°C下10000rpm離心10min，得到第一DNA上清液，將第一DNA上清液置于離心管中，加入上述第二有機溶液5μl，上下顛倒混合均勻，在4°C下10000rpm離心10min，得到第二DNA上清液，將第二DNA上清液置于另一離心管中，加入濃度為3mol/L的醋酸鈉溶液，所述醋酸鈉溶液與所述第二DNA上清液的體積比1：10，再加入所述第二DNA上清液二倍體積的-20°C無水乙醇，置于-20°C冰箱中培養，至大量絲狀DNA沉淀出現，然后以10000rpm離心10min，棄上清液，得到DNA純化物，加入TE緩沖液50μl溶解DNA純化物，得到模板DNA溶液，置于-20°C保存備用；

5）檢測：取上述模板DNA溶液1μl，用所述香魚假單胞菌熒光定量PCR檢測試劑盒檢測，反應體系20μL，在Mastercycler?ep?realplex2熒光定量PCR儀上擴增反應，擴增反應條件為第一步：預變性95°C，30sec，1循環；第二步：PCR反應，變性95°C，5sec、退火60°C，30sec、延伸72°C，30sec共40循環；第三步：95°C，15sec、60°C，15sec、95°C，15sec，PCR反應結束，得到擴增曲線圖和熔解曲線圖及Ct值，若與建立的香魚假單胞菌DNA的PCR反應的擴增曲線和熔解曲線基本相似，則含有香魚假單胞菌，將檢測出的Ct值代入建立的香魚假單胞菌DNA的標準曲線，計算出DNA含量。