[發(fā)明專利]腸道病毒71型的GFP示蹤系統(tǒng)及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310226099.2
• 申請日: 2013-06-07
• 公開（公告）號: CN103289964A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 常國輝;劉京梅;孫走南;楊益;蘇文莉;唐玥;何湘
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/63;C12N15/863;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種腸道病毒71型的GFP示蹤系統(tǒng)及其應(yīng)用，特別涉及一種在野生型腸道病毒71型安徽分離株1基因組中插入GFP編碼基因后得到的重組腸道病毒71型。

背景技術(shù)

腸道病毒71型（EV71）屬于小RNA病毒科（Picornaradae）腸道病毒屬（Enterovirus）的成員。EV71的病毒顆粒為二十面體立體對稱的球形結(jié)構(gòu)，無包膜和突起，直徑大約在24～30nrn，核酸為單股正鏈RNA。自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)腸道病毒71型，已有3次EV71引起的大范圍手足口?。℉and?foot?and?mouth?disease?HFMD）流行，每次都有死亡病例的發(fā)生。EV71病毒在學(xué)齡前兒童特別是5歲以下年齡組發(fā)病率最高，除引發(fā)一般的手足口病的臨床癥狀外，還可引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給家庭和社會(huì)造成了沉重負(fù)擔(dān)。

綠色熒光蛋白（green?fluorescent?protein，GFP）是來源于發(fā)光水母（aequorea?victoria）的一種功能獨(dú)特的蛋白質(zhì)，分子量為27kD，由238個(gè)氨基酸組成。自1992年P(guān)rasher等克隆到GFP的cDNA以來，GFP示蹤技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。結(jié)合GFP熒光示蹤的技術(shù)手段，可分別在細(xì)胞和動(dòng)物水平，對標(biāo)記分子或物質(zhì)進(jìn)行熒光示蹤監(jiān)測和定量檢測。

目前尚未有對EV71進(jìn)行GFP示蹤的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種腸道病毒71型的GFP示蹤系統(tǒng)及其應(yīng)用。所述腸道病毒71型的GFP示蹤系統(tǒng)即為一種表達(dá)綠色熒光蛋白的重組腸道病毒71型。

本發(fā)明所提供的重組腸道病毒71型，是將野生型腸道病毒71型基因組RNA進(jìn)行替換或插入得到的重組病毒；

所述替換為：將所述野生型腸道病毒71型基因組RNA中的片段a中的任一片段（可由1個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)核糖核苷酸組成）替換為片段b；

所述插入為：在所述野生型腸道病毒71型基因組RNA中的所述片段a中的任一位點(diǎn)處插入所述片段b；

所述片段a為序列表中序列1編碼的RNA；所述片段b為含有綠色熒光蛋白編碼基因的DNA片段編碼的RNA。

所述綠色熒光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

在本發(fā)明中，所述綠色熒光蛋白的編碼基因的序列為序列表中序列3的第142-861位。

進(jìn)一步，所述含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列3。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述野生型腸道病毒71型具體為腸道病毒71型安徽分離株1（Anhui1-09-China）。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組腸道病毒71型是將野生型腸道病毒71型基因組RNA進(jìn)行插入得到的重組病毒；具體的，所述插入中，所述“片段a中的任一位點(diǎn)”為所述片段a中的序列1的第450位核苷酸和第451位核苷酸之間。

由于所述野生型腸道病毒71型安徽分離株1（Anhui1-09-China）的基因組RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA序列為GenBank號為GQ994988.1的序列（Up?date：2010-5-18），相應(yīng)的，所述重組腸道病毒71型的基因組RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA序列為在GenBank號為GQ994988.1的序列（Up?date：2010-5-18）的第3346位和第3347位（對應(yīng)序列1的第450位和第451位）之間插入序列表中序列3后得到的核苷酸序列。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備所述重組腸道病毒71型的方法。

本發(fā)明所提供的制備所述重組腸道病毒71型的方法具體可包括如下步驟：

（a）將所述野生型腸道病毒71型基因組RNA通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列分別克隆至質(zhì)粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質(zhì)粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)位于序列1中；

（b）用含所述野生型腸道病毒71型基因組RNA通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA序列的痘苗病毒載體甲感染CV-1細(xì)胞后，用步驟（a）獲得的重組質(zhì)粒甲轉(zhuǎn)染所述CV-1細(xì)胞，所述痘苗病毒載體甲與所述重組質(zhì)粒甲通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列發(fā)生同源重組，獲得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒載體甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒載體甲中的所述待插入位點(diǎn)處插入所述gpt基因的重組痘苗病毒載體乙；