[發明專利]腸道病毒71型的GFP示蹤系統及其應用

有效

• 申請號: 201310226099.2
• 申請日: 2013-06-07
• 公開（公告）號: CN103289964A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 常國輝;劉京梅;孫走南;楊益;蘇文莉;唐玥;何湘
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/63;C12N15/863;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.重組腸道病毒71型，是將野生型腸道病毒71型基因組RNA進行替換或插入得到的重組病毒；

所述替換為：將所述野生型腸道病毒71型基因組RNA中的片段a中的任一片段換為片段b；

所述插入為：在所述野生型腸道病毒71型基因組RNA中的所述片段a中的任一位點處插入所述片段b；

所述片段a為序列表中序列1編碼的RNA；所述片段b為含有綠色熒光蛋白編碼基因的DNA片段編碼的RNA。

2.根據權利要求1所述的重組腸道病毒71型，其特征在于：所述綠色熒光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3.根據權利要求2所述的重組腸道病毒71型，其特征在于：所述綠色熒光蛋白的編碼基因為序列表中序列3的第142-861位。

4.根據權利要求1-3中任一所述的重組腸道病毒71型，其特征在于：所述含有綠色熒光蛋白編碼基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列3。

5.根據權利要求1-4中任一所述的重組腸道病毒71型，其特征在于：所述野生型腸道病毒71型為腸道病毒71型安徽分離株1；或

所述插入中，所述片段a中的任一位點為所述片段a中的序列1的第450位和第451位核苷酸之間。

6.根據權利要求5所述的重組腸道病毒71型，其特征在于：所述重組腸道病毒71型的基因組RNA反轉錄的cDNA序列為在GenBank號為GQ994988.1的序列的第3346位和第3347位核苷酸之間插入序列表中序列3所示DNA片段后得到的核苷酸序列。

7.制備權利要求1-6中任一所述重組腸道病毒71型的方法，包括如下步驟：

（a）將權利要求1-5任一中所述的野生型腸道病毒71型基因組RNA通過反轉錄得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列分別克隆至質粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位點位于序列1中；

（b）用含權利要求1-5任一中所述野生型腸道病毒71型基因組RNA通過反轉錄得到的cDNA序列的痘苗病毒載體甲感染CV-1細胞后，用步驟（a）獲得的重組質粒甲轉染所述CV-1細胞，所述痘苗病毒載體甲與所述重組質粒甲通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列發生同源重組，獲得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒載體甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒載體甲中的所述待插入位點處插入所述gpt基因的重組痘苗病毒載體乙；

（c）將步驟（a）中的所述重組質粒甲中的所述gpt基因替換為權利要求1-4任一中所述的含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段，得到重組質粒乙；

（d）用步驟（b）得到的重組痘苗病毒載體乙感染新的CV-1細胞后，用步驟（c）獲得的重組質粒乙轉染所述新的CV-1細胞，所述重組痘苗病毒載體乙與所述重組質粒乙通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列發生同源重組，獲得以所述含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段替代所述重組痘苗病毒載體乙中所述gpt基因的重組痘苗病毒載體丙；

（e）提取步驟（d）得到的重組痘苗病毒載體丙的基因組DNA，通過體外轉錄，獲得所述重組痘苗病毒載體丙的基因組的全長RNA；將所述全長RNA轉染BHK-21細胞，培養轉染后的細胞，獲得所述重組腸道病毒71型。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法的步驟（a）中，位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列分別為GenBank號為GQ994988.1的序列的第2897-3346位和第3347-3797位的序列。

9.權利要求1-6中任一所述重組腸道病毒71型在如下（a1）或（a2）中的應用：

（a1）制備研究腸道病毒71型感染機制的產品；

（a2）制備篩選抗腸道病毒71型藥物的細胞模型。

10.如下（b1）或（b2）的生物材料：

（b1）含有權利要求1-6中任一所述重組腸道病毒71型的離體動物細胞或重組菌；

（b2）含有權利要求1-6中任一所述重組腸道病毒71型的基因組RNA或cDNA的載體。