[發明專利]一種在磁珠表面共價偶聯蛋白質的方法

無效

• 申請號: 201310226070.4
• 申請日: 2013-06-07
• 公開（公告）號: CN103323603A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 郭建夫;楊寶君;韓學棟;周玉祥
• 申請（專利權）人: 博奧生物有限公司;清華大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531;G01N33/543
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種在磁珠表面共價偶聯蛋白質的方法。

背景技術

磁珠，又稱磁性微粒，是一類直徑在納米或微米級的球形復合材料。磁珠由三部分組成，核心是金屬小顆粒（氧化鐵、四氧化三鐵），核心外均勻包裹一層高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯等），最外層是功能基層，具有功能基團，如氨基（-NH₂）、羧基（-COOH）、羥基（-OH）等。

磁珠呈均勻球形，具有超順磁性，使磁珠可以在外加磁場作用下向磁場方向移動達到分離目標物的目的，最外層的化學功能基團被用來與蛋白質或核酸等生物活性分子偶聯。偶聯后的磁珠廣泛用于細胞分離與純化、細胞分型、免疫檢測、核酸分離、靶向釋藥系統等領域。

羧基磁珠，即最外層具有羧基功能基團（-COOH）的磁珠，是較為常用的一類磁珠。目前羧基磁珠與蛋白質的偶聯方法有很多種。由于活化劑的選擇、活化條件、偶聯條件及偶聯工藝上的差異，導致偶聯蛋白質的磁珠存在偶聯效率低、蛋白利用率低、偶聯磁珠自身凝集、磁珠非特異吸附嚴重、不能通用等不足。

發明內容

本發明的目的是提供一種在磁珠表面共價偶聯蛋白質的方法。

本發明提供的在磁珠表面共價偶聯蛋白質的方法，包括如下步驟：

（1）將磁珠與活化劑共孵育，得到活化后的磁珠；

（2）將所述活化后的磁珠與蛋白質共孵育，得到偶聯有所述蛋白質的磁珠；

（3）將所述偶聯有所述蛋白質的磁珠用封閉液進行處理，封閉表面的活性位點；

（4）將步驟（3）得到的磁珠邊進行振蕩邊過篩（以除去團聚的磁微粒），收集過篩后的磁珠。

所述步驟（1）中，所述磁珠可為羧基磁珠。所述步驟（1）中，所述活化后的磁珠表面具有含N-羥基丁二酰亞胺鍵的化學基團。所述步驟（1）中，所述活化劑可為EDC和NHS，或所述活化劑可為EDC和Sulfo-NHS。所述步驟（1）中，所述共孵育的反應體系可為pH4.0-7.0、0.01-0.1M的MES緩沖液。所述步驟（1）中，所述活化劑為EDC和NHS時，所述EDC的初始濃度可為0.1-30mM，所述NHS的初始濃度可為0.3-100mM。所述步驟（1）中，所述活化劑為EDC和Sulfo-NHS時，所述EDC的初始濃度可為0.1-30mM，所述Sulfo-NHS的初始濃度可為0.3-100mM。所述步驟（1）中，所述共孵育的時間可為6-300分鐘，優選為10-240分鐘。所述步驟（1）中，所述共孵育的溫度具體可為室溫。

所述步驟（2）中，所述共孵育的反應體系可為pH4.0-7.0、0.01-0.1M的MES緩沖液；所述步驟（2）中，所述共孵育的條件可為：2-26℃、2-20小時。

所述步驟（3）中，所述封閉液可為含0.2-5g/100mL封閉蛋白的緩沖液，優選為含1-5g/100mL?BSA的緩沖液。所述緩沖液可為MES緩沖液、PBS緩沖液或Tris緩沖液。MES緩沖液即2-（嗎啉代）乙磺酸緩沖液。PBS緩沖液即磷酸鹽緩沖液。Tris緩沖液即三羥甲基氨基甲烷緩沖液。所述步驟（3）中，所述“將所述偶聯有所述蛋白質的磁珠用封閉液進行處理”的處理時間可為1-9小時，優選為90-180分鐘。所述步驟（3）中，所述共孵育的溫度具體可為室溫。

所述步驟（4）中，所述過篩可為過800目-1500目篩。所述過篩具體可為過不銹鋼篩網。所述不銹鋼篩網具體可為304鋼不銹鋼篩網或316鋼不銹鋼篩網。所述步驟（4）中，所述過篩借助的液相體系具體可為pH4.0-7.0、0.01-0.1M的MES緩沖液。

所述方法還可包括將步驟（4）得到的過篩后的磁珠用保存液混懸后4℃保存的步驟。所述保存液為含有0.1-5g/100mL?BSA和0.1g/100mL?NaN₃的pH7-10、0.01-0.1MTris緩沖液。

所述步驟（2）中，所述蛋白質具體可為抗體，如羊抗異硫氰酸熒光素IgG抗體或甲狀腺素單克隆抗體。

本發明還保護以上任一所述方法制備得到的磁珠產品。

本發明還保護所述磁珠產品在鑒定和/或分離與所述蛋白質結合的物質中的應用。所述蛋白質為抗體時，所述“與所述蛋白質結合的物質”為與所述蛋白質特異結合的抗原或二抗。

本發明具有如下優點：

（1）蛋白偶聯效率高；使用雙活化劑EDC和NHS活化磁珠，可以使磁珠上的活化羧基處于半穩定狀態，不易水解，加入蛋白質后，與蛋白質側鏈的氨基形成穩定的酰胺鍵，增加了磁珠和抗體的利用率，增加了偶聯效率；