[發明專利]一種固定化脂肪酶及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310222770.6
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103232992A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 何冰芳;李文豪;汪斌;趙洋陽;吳斌
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12P7/62;C12P41/00;C12N9/20
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術領域

本發明屬于生物化工及酶工程領域，涉及一種固定化脂肪酶及其制備方法和應用，具體地涉及了一種以表面修飾的介孔TiO₂為載體來制備固定化脂肪酶的方法，以及該固定化脂肪酶在有機相中催化酯類合成和拆分手性化合物中的應用。

背景技術

脂肪酶（lipase,?EC?3.?1.?1.?3，甘油三酰酯水解酶）是一種可以催化天然底物三酰甘油酯水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯的酶類。脂肪酶可以催化諸如水解、酯化、轉酯等多種類型的反應，并且具有較高的立體選擇性、底物專一性和區域選擇性。作為一種具有多種催化功能的酶，脂肪酶被廣泛應用在食品、能源、日化、醫藥等重要的工業領域。盡管脂肪酶已經被許多科學家證實為最重要的工業用酶之一，但其每年的銷售額只占全世界酶制劑市場的4%。由于游離脂肪酶不能重復利用、不穩定且在有機相中容易“團聚”而失活，這些都使得工業生產過程中脂肪酶的成本居高不下，另外游離脂肪酶還存在后續與產物分離不易，不利于連續化生產等缺陷，這些因素共同制約了脂肪酶在工業上的大量使用。通過化學或物理方法可以將脂肪酶固定在水不溶性的載體上將其制備成固定化脂肪酶使得其既能保持了脂肪酶的催化特性同時又具備了可回收利用，后續過程中容易與產物分離、能夠實現連續化生產等特性。因此，固定化酶將能極大提升脂肪酶在工業生產中的應用范圍。

酶的固定化有吸附、交聯、包埋以及共價結合等方法，其中交聯和共價結合的固定化方式可能會影響到酶的活性中心導致固定化過程中酶活的損失。而靠物?理吸附來實現的固定化過程有著條件溫和、吸附量可控、不存在酶活損失等優點。游離酶經固定化后，其載體表面的微環境對提高固定化酶的催化活力和穩定性有著重要的影響。脂肪酶在催化油脂類底物水解時在油水界面有明顯的“界面激活”效應。這是由于在脂肪酶活性中心上方覆蓋有一些二級結構（通常所稱的“lid”蓋子結構），當脂肪酶不在油水界面時，這些“lid”結構覆蓋在活性中心上方，阻礙了催化底物進入到脂肪酶的活性中心，然而，當脂肪酶存在于一個疏水的界面時，它的分子構象發生了轉變，活性部位從一種蓋關閉的狀態轉化為敞開狀態使得底物能夠進入到活性中心。這個構象的改變同時也導致了脂肪酶暴露出其表面的疏水區域，通過與這些疏水區域的相互作用也可以使得脂肪酶的活力得到提高。由此看來，脂肪酶可以通過活性中心周圍的疏水殘基定向的吸附到一些經過修飾的疏水材料的表面。因此，這種脂肪酶的“界面激活”機制也可以作為一種脂肪酶固定化的工具，它提供了一種新的簡便易行的脂肪酶定向固定化方式。

固定化酶的載體材料一般有無機材料、天然高分子材料、合成高分子材料等。一種良好的固定化酶載體材料要有一定的機械強度，良好的熱穩定性、化學穩定性、生物相容性。近來興起的二氧化鈦介孔材料作為一種新型的高性能材料備受關注，在操作過程中二氧化鈦介孔材料可以實現納米級別孔徑的可控調節。這種新型的介孔二氧化鈦材料具有很高的比表面積、孔徑均一等特點，并且表面富含豐富的活性羥基，容易對其表面進行活性修飾。

發明內容

本發明的技術目的旨在提供一種高效、穩定、分散性好的固定化脂肪酶及其制備方法，使得該固定化脂肪酶可以在有機相中應用于水解、酯化、轉酯等多種類型的反應。

為了解決現有技術的技術問題，實現本發明的技術目的，本發明的技術方案如下。

一、一種固定化脂肪酶的制備方法，是由固定化載體和吸附在固定化載體上的脂肪酶（lipase,?EC?3.?1.?1.?3，甘油三酰酯水解酶）吸附結合而制得，其特征在于具體制備方法如下：

（1）載體制備：

利用硅烷偶聯劑對預處理后的介孔TiO₂進行表面疏水改性，具體方法為：取預處理后的介孔TiO₂，加入甲苯，預熱5~20min,?再加入硅烷偶聯劑，在N₂保護下，?30~90℃攪拌，回流反應1~24h，離心棄上清，將沉淀用甲苯、丙酮、無水乙醇依次分別洗滌后，真空干燥得表面改性的介孔TiO₂。考察其中，所述預處理的介孔TiO₂與甲苯的質量體積比按g/mL計為1:100~500；優選范圍為1:100~300，最優配比為1:200；

所述預處理的介孔TiO₂與硅烷偶聯劑的質量摩爾比以g/mmol計為10~1:1，優選為2:1。