[發明專利]溫敏性固定化木瓜蛋白酶及其在制備單克隆抗體中的應用

無效

• 申請號: 201310221532.3
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103275961A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 應國清;易喻;黃婷婷;梅建鳳;王鴻;陳建澍;張彥璐
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08;C12P21/08;C12P21/06
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一種溫敏性的固定化木瓜蛋白酶，及其在制備單克隆抗體中的應用。

（二）背景技術

單克隆抗體（Monoclonal?Antibody）是由識別一種抗原決定簇的細胞克隆所產生的均一性抗體。它的理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結合的特異性強、便于人為處理和質量控制，并且來源容易。這些優點使單克隆抗體一問世就受到高度重視，并成為解決生物學和醫學等許多重大問題的重要手段。

盡管單克隆抗體其在疾病的診斷、治療等方面有著明顯的優勢，但是，常規單克隆抗體應用也具有明顯的局限性，主要體現在其抗原性以及分子結構的大而復雜性，前者易產生治療中的排異等副作用，后者造成其組織的穿透力差，特異性低，表達復雜且困難。抗體Fab或F(ab’)₂片段由于去掉了抗體恒定區(Fc)，免疫原性及分子量大大減小，穿透性強，同時還能保留對原抗原的結合能力，因而藥物動力學性質得到改善，更有利于臨床應用。此外，在許多生物制藥的研發工作中往往需要使用某個單克隆抗體片段而不是整個免疫球蛋白分子。

目前單克隆抗體片段常用酶解法制備獲得。木瓜蛋白酶（EC.3.4.22.2）是一種半胱氨酸肽鏈內切酶，被廣泛用于抗體片段的制備。用于酶解反應的木瓜蛋白酶有游離及固定化兩種狀態。用游離酶消化抗體，雖然游離酶的酶活力高，但是在水解過程中不易與產物分離，不利于后續的產物純化，而且反應較難控制，酶也難于重復利用。隨著固定化技術的發展，人們逐漸將固定化的木瓜蛋白酶應用于抗體水解領域。現階段使用的固定化酶均為固相化，此類固定化酶雖具有固定化酶的易于與底物、產物分離，在較長時間內重復利用，多數情況下穩定性提高，酶反應過程能加以嚴格控制等優點，但在水中擴散限制大，催化效率低下。

（三）發明內容

本發明目的是提供一種溫敏性的固定化木瓜蛋白酶，及其在制備單克隆抗體中的應用。該材料固定化木瓜蛋白酶在常溫下溶于水形成均相，當溫度超過其最低臨界溶解溫度時便固相析出，以此為載體制備的固定化酶具有了熱應答性質，將傳統固定化可重復利用等優點及可溶性酶較少擴散限制等優點結合在一起，具有較好應用前景。

本發明采用的技術方案是：

一種溫敏性的固定化木瓜蛋白酶，由如下方法制備得到：

（1）將DMF（二甲基甲酰胺）用分子篩干燥，溫敏性載體溶于干燥過的DMF中，溫敏性載體與DMF的比例是1g：1～10mL，得到載體溶液；所述溫敏載體為N-羥基琥珀酰亞胺酯封端的聚（N-異丙基丙烯酰胺），平均分子量為2000，其結構式為如下：

（2）將木瓜蛋白酶溶于pH7.5～10.0的硼酸鹽緩沖液中，調酶液濃度至1～10mg/mL（≥10U/mg），得到酶溶液；

（3）將載體溶液與酶溶液混合，于4～55℃反應1～8h，反應液用pH7.5～10.0的硼酸鹽緩沖液稀釋；

（4）40℃空氣浴中，11000r/min離心20min，除去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，再于相同條件下離心；

（5）重復步驟（4）的操作2～3次，最后所得沉淀溶于新配的磷酸鹽緩沖液中，4℃保存，即得溫敏性的固定化木瓜蛋白酶溶液。

本發明還涉及所述的溫敏性的固定化木瓜蛋白酶在制備單克隆抗體片段中的應用。

具體的，利用本發明溫敏載體固定化木瓜蛋白酶制備抗體片段的方法如下：將溫敏性的固定化木瓜蛋白酶溶于含有保護劑（5mmol/L半胱氨酸和2mmol/L?EDTA）的pH為4.0～9.0的磷酸鹽緩沖液中，20～45℃水浴放置30min，取出。抗體用相同的緩沖液透析后，調濃度為1～10mg/mL，加入固定化酶液，酶與抗體的比為1:1～20（m:m），20～45℃水浴振蕩，消化1～22h。然后40℃，11000r/min離心20min，上清即為消化后的抗體片段，沉淀（固定化酶）用磷酸鹽緩沖液溶解，用于下一次抗體片段的制備。所得的抗體片段混合液采用蛋白A-蛋白L親和層析法純化，得到高純度的單克隆抗體片段。蛋白A為金黃色葡萄球菌的表面蛋白，分子量為42KD，有6個不同的IgG結合位點；蛋白質L是一種來源于細菌大消化鏈球菌（Peptostreptococcusmagnus）的免疫球蛋白結合蛋白，與主要通過免疫球蛋白Fc區域（例如，重鏈）結合的蛋白A和蛋白G不同，蛋白質L通過與輕鏈發生相互作用而與Igs結合。