[發(fā)明專利]一種家蠶抗菌肽attacin2及其異源表達(dá)和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310220040.2
• 申請日: 2013-06-04
• 公開（公告）號: CN104212805A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李翼;李智;梁杏媚;藍(lán)希鉗;劉璇
• 申請（專利權(quán)）人: 香港理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/435;A61K38/17;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市順天達(dá)專利商標(biāo)代理有限公司 44217
• 代理人: 郭偉剛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，并涉及一種具有抑菌作用的家蠶抗菌肽attacin2。更具體地，本發(fā)明涉及一種在原核生物中異源表達(dá)的家蠶抗菌肽attacin2、編碼該抗菌肽的基因序列、包含該基因序列的原核表達(dá)載體以及該抗菌肽在抑制細(xì)菌生長中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

抗菌肽是一類天然小分子多肽。近年來，研究者普遍認(rèn)為抗菌肽最有可能成為現(xiàn)有抗生素的替代品，這是因為其在具有廣譜抗菌作用的同時并不會誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。抗菌肽最早發(fā)現(xiàn)于昆蟲體內(nèi)，隨后在植物、真菌和其他動物中也相繼發(fā)現(xiàn)存在抗菌肽。目前，家蠶體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)并報道的抗菌肽包括cecropin、moricin、attacin、gloverin、defensin、enbocin和lebocin。?

attacin又稱攻擊素，是一類富含甘氨酸的抗菌肽，分子量通常為20KD左右。研究表明，attacin主要對革蘭氏陰性細(xì)菌有較強的抑菌作用，可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。家蠶被外源細(xì)菌感染后誘導(dǎo)所產(chǎn)生的抗菌肽attacin的含量較少，很難從家蠶體內(nèi)直接分離純化。因此，只有通過異源表達(dá)才能獲得大量的家蠶抗菌肽attacin。?

常用的異源表達(dá)方式有酵母表達(dá)、細(xì)胞表達(dá)和原核表達(dá)，其中原核表達(dá)的方法因操作簡單、耗時短且表達(dá)量高等得到最為普遍的應(yīng)用。但現(xiàn)有技術(shù)中尚缺少有關(guān)如何通過異源表達(dá)制備家蠶抗菌肽attacin2的方法。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對現(xiàn)有技術(shù)中難以從家蠶體內(nèi)直接分離?得到家蠶抗菌肽attacin2且尚不存在家蠶抗菌肽attacin2的異源表達(dá)方法的缺陷，提供用于異源表達(dá)家蠶抗菌肽attacin2的基因、原核表達(dá)載體和表達(dá)菌株，從而實現(xiàn)家蠶抗菌肽attacin2的量化生產(chǎn)。與此同時，本發(fā)明還提供采用異源表達(dá)方法制得的家蠶抗菌肽attacin2及其在抑菌細(xì)菌生長方面的應(yīng)用。?

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：提供一種家蠶抗菌肽attacin2的編碼基因，其堿基序列如SEQ?ID?No:1所示。?

優(yōu)選地，對所述編碼基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增使用的引物序列為：?

attacin2-28a-F：5’-CAT?GCC?ATG?GGC?CAA?GCC?GGC?AGC?TTC?ACA?GT-3’?

attacin2-28a-R：5’-CCG?CTC?GAG?TTA?ATG?ATG?ATG?ATG?ATG?ATG?GAA?GAA?TTT?AGA?GAA?GGA?GA-3’。?

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種家蠶抗菌肽attacin2的重組載體，該重組載體包含如SEQ?ID?No:1所示的家蠶抗菌肽attacin2的編碼基因。?

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有重組載體的BL21菌株，該重組載體包含如SEQ?ID?No:1所示的家蠶抗菌肽attacin2的編碼基因。?

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種家蠶抗菌肽attacin2，其具有如SEQ?ID?No:4所示的氨基酸序列。?

優(yōu)選地，所述家蠶抗菌肽attacin2為成熟肽，所述成熟肽的家蠶抗菌肽attacin2的N端包含6個組氨酸構(gòu)成的檢測標(biāo)簽。?

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種異源表達(dá)家蠶抗菌肽attacin2的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟：?

獲取家蠶抗菌肽attacin2的編碼基因；?

構(gòu)建重組載體：將家蠶抗菌肽attacin2的編碼基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體中，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pMD18-attacin2；分別酶切重組質(zhì)粒pMD18-attacin2和原核表達(dá)載體pET28a，構(gòu)建得到包含家蠶抗菌肽attacin2的編碼基因的重組載體pET28a-attacin2；?

表達(dá)家蠶抗菌肽attacin2：將重組載體pET28a-attacin2轉(zhuǎn)化至BL21菌株中，利用IPTG誘導(dǎo)后收集包含家蠶抗菌肽attacin2的細(xì)菌。?

優(yōu)選地，所述方法還包括：?

破碎BL21菌株，采用尿素溶液處理離心破碎后的細(xì)胞菌液，隨后離心并收集沉淀，獲得的上清加樣于組氨酸蛋白純化柱上，洗脫后獲得純化的家蠶抗菌肽attacin2；?

以及純化的家蠶抗菌肽attacin2經(jīng)PBS透析復(fù)性，并經(jīng)冷凍干燥制得粉末態(tài)的所述家蠶抗菌肽attacin2。?