[發(fā)明專利]一種高效快速的富集分離副溶血性弧菌方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310219540.4
• 申請(qǐng)日: 2013-06-05
• 公開（公告）號(hào): CN103305441A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐鋒;魏華;許恒毅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12R1/63
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及基于納米磁珠的食源性致病菌分離方法。

背景技術(shù)

副溶血性弧菌（vibrio?parahaemolyticus，VP），弧菌屬，是一種革蘭陰性嗜鹽的多形態(tài)細(xì)菌。廣泛分布于近海岸的海水、海底泥沙、浮游生物和魚、?蝦、貝類等海產(chǎn)品中。能引起急性腸胃炎和原發(fā)性敗血癥，據(jù)衛(wèi)生部報(bào)告，?2008年第2季度全國食物中毒情況中副溶血性弧菌引起的食物中毒居微生物性食物中毒的第2位，僅次于蠟樣芽胞桿菌。建立一種高效快速檢測(cè)副溶血性弧菌的新方法顯得尤為迫切，鑒于需要建立一種高效，快速的檢測(cè)方法，免疫磁分離技術(shù)在食源性致病菌監(jiān)測(cè)中得到了迅速發(fā)展。

免疫磁分離技術(shù)是食源性致病菌快速篩查技術(shù)的重要組成部分之一，該技術(shù)可高效捕獲、濃縮增菌液中目標(biāo)菌、提高致病菌檢測(cè)靈敏度和縮短檢測(cè)時(shí)間。近年來，基于磁性微珠的免疫磁分離法（IMS）將目標(biāo)菌抗體連接到磁珠上，然后將連有抗體的磁珠投入樣品液中對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行捕獲、富集，磁分離（具體原理見圖2A）。然而，目前該基于微米級(jí)免疫磁珠的分離技術(shù)存在諸多局限性：1）微米磁珠的比表面積相對(duì)較小，降低了磁珠捕獲效率；2）由于微米磁珠自身的顆粒性質(zhì)，其與細(xì)菌細(xì)胞之間通過多相反應(yīng)（multiphase?reaction）結(jié)合，通常需要更長(zhǎng)的時(shí)間去特異性捕獲食品基質(zhì)中的細(xì)菌細(xì)胞；3）微米磁珠單分散性較差，在食品基質(zhì)液中容易發(fā)生自身聚集或形成沉淀；4）傳統(tǒng)的免疫磁分離技術(shù)，往往是將抗體分子直接偶聯(lián)于免疫磁珠上，此過程常常會(huì)導(dǎo)致抗體的活性大大地降低并且導(dǎo)致抗體的空間方向發(fā)生改變?cè)龃罅丝贵w間的空間位阻效應(yīng)，從而降低了抗體的捕獲效率5）食品基質(zhì)性質(zhì)復(fù)雜并且其中非目的致病菌的雜菌濃度大，微米磁珠容易產(chǎn)生非特異性吸附，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)食品樣液中目的菌的特異性分離；6）微米磁珠的濃度過高會(huì)造成細(xì)菌細(xì)胞的破損（磁場(chǎng)導(dǎo)致細(xì)胞表面磁珠互相吸引，使細(xì)胞受到擠壓甚至破裂），導(dǎo)致分離的失敗；7）磁珠偶聯(lián)抗體時(shí)，一般采用疏水吸附或化學(xué)偶聯(lián)方式將具有活性的抗體聯(lián)接在磁珠表面。抗體與磁珠表面距離太近，磁珠本身性質(zhì)及其表面殘留的疏水或強(qiáng)親水基團(tuán)容易引起抗體空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致抗體生物活性下降。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種捕獲效率高、簡(jiǎn)便、分離時(shí)間短，低梯度磁場(chǎng)下（小于30?T/m）從復(fù)雜的食品基質(zhì)中快速、特異分離目的菌副溶血性弧菌的方法。

一種高效快速的富集分離副溶血性弧菌方法，包括以下步驟：

（1）每取1?mg樹狀超支聚合物溶解于2?mL?0.02?M，pH?6.5磷酸緩沖液PBS，加入0.6?mg?N-羥基丁二酰亞胺NHSS，0.4?mg?乙基3-（3-二甲氨基）碳二亞胺鹽酸鹽EDC，室溫置于混勻儀上攪拌，活化15?min；加入2.68?mg副溶血性弧菌特異性抗體，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結(jié)束將得到的溶液冷凍干燥得樹狀超支聚合物-抗體復(fù)合物；（2）取15?mg?長(zhǎng)鏈生物素，3.6?mgN-羥基丁二酰亞胺NHSS，2.4?mg?乙基3-（3-二甲氨基）碳二亞胺鹽酸鹽EDC溶解于2?mL?0.02?M?pH?6.5?PBS緩沖液中；加入2.24?mg樹狀超支聚合物-抗體復(fù)合物，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結(jié)束將得到的溶液冷凍干燥得長(zhǎng)鏈生物素-樹狀超支聚合物-抗體復(fù)合物；（3）取1?mL待測(cè)樣品溶液，加入0.1?mg副溶血性弧菌抗體和長(zhǎng)鏈生物素共修飾的樹狀超支聚合物即長(zhǎng)鏈生物素-樹狀超支聚合物-抗體復(fù)合物，置于混勻儀上，以30?rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育15?min；加入0.1?mg修飾有鏈霉親和素的納米磁珠，置于混勻儀上，以30?rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育15?min，常規(guī)磁力架分離3?min；（4）磁力分離后，用0.1%?PBST洗滌后，用PBS緩沖液重懸即得捕獲有副溶血性弧菌的納米磁珠-鏈霉親和素-長(zhǎng)鏈生物素-樹狀超支聚合物-抗體-副溶血性弧菌抗原復(fù)合物。

所述樹狀超支聚合物為為氨基化的樹枝狀化聚酰胺-胺，其分子量為56000?Da。結(jié)構(gòu)如圖1。

所述納米磁珠粒徑為20-50nm，優(yōu)選為30?nm。

樹狀超支聚合物通過氨基和副溶血性弧菌特異性抗體的羧基實(shí)現(xiàn)樹狀超支聚合物和抗體的共價(jià)偶聯(lián)。

樹狀超支聚合物通過氨基和長(zhǎng)鏈生物素分子的羧基，實(shí)現(xiàn)樹狀超支聚合物和長(zhǎng)鏈生物素的共價(jià)偶聯(lián)；加入過量長(zhǎng)鏈生物素以保證封閉樹狀超支聚合物上裸露的氨基位點(diǎn)。