[發(fā)明專利]金黃色葡萄球菌分離的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310219458.1
• 申請(qǐng)日: 2013-06-05
• 公開（公告）號(hào): CN103333818A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏華;許恒毅;徐鋒;萬(wàn)翠香
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12R1/445
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及基于納米磁珠的食源性致病菌分離方法。

背景技術(shù)

食源性致病菌污染是我國(guó)食品安全的重大問題之一。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，發(fā)達(dá)國(guó)家每年約有三分之一的人感染食源性疾病，全世界每年有220萬(wàn)人因患食源性疾病而喪生。在我國(guó)，每年食物中毒例數(shù)在20～40萬(wàn)人，除意外事故外，大部分均由食源性致病菌引起。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus,?SA)作為常見的食源性致病菌之一，是我國(guó)衛(wèi)生部唯一允許在速凍品牌食品中允許限量存在的致病菌。然而，由其引起的中毒事件時(shí)有發(fā)生，且危害嚴(yán)重，主要表現(xiàn)在產(chǎn)生致病性腸毒素，可引起人體化膿性感染，如可引起局部化膿感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。同時(shí)，金黃色葡萄球菌也是引起醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌，如通過污染的器械用品引起化膿性感染、注射部位化膿性感染、支氣管炎、肺炎等。因此，不論是在食源性致病菌檢測(cè)還是在臨床致病菌早期檢驗(yàn)方面，發(fā)展快速、高效富集分離樣品中金黃色葡萄球菌的技術(shù)都是極有必要。?

免疫磁分離技術(shù)是食源性致病菌快速篩查技術(shù)的重要組成部分之一，該技術(shù)可高效捕獲、濃縮增菌液中目標(biāo)菌，提高致病菌檢測(cè)靈敏度。近年來，基于磁性微珠的免疫磁分離法（IMS）將目標(biāo)菌抗體連接到磁珠上，然后將連有抗體的磁珠投入樣品液中對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行捕獲、富集，磁分離（具體原理見圖2A）。然而，目前該基于微米級(jí)免疫磁珠的分離技術(shù)存在諸多局限性：1）相對(duì)納米級(jí)磁珠，微米磁珠的比表面積較小，降低了磁珠捕獲效率；2）由于微米磁珠自身的顆粒性質(zhì)，其與細(xì)菌細(xì)胞之間通過多相反應(yīng)（multiphase?reaction）結(jié)合，通常需要更長(zhǎng)的時(shí)間去特異性捕獲食品基質(zhì)中的細(xì)菌細(xì)胞；3）微米磁珠單分散性較差，在食品基質(zhì)液中容易發(fā)生自身聚集或形成沉淀；4）傳統(tǒng)的免疫磁分離技術(shù)，往往是將抗體分子直接偶聯(lián)于免疫磁珠上，此過程常會(huì)導(dǎo)致抗體活性較大地降低及抗體空間方向的改變，增大了抗體間的空間位阻效應(yīng)，從而降低了抗體的捕獲效率；5）食品基質(zhì)性質(zhì)復(fù)雜并且其中非目的致病菌（雜菌）濃度大，微米磁珠容易產(chǎn)生非特異性吸附，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)食品樣液中目的菌的特異性分離；6）微米磁珠的濃度過高會(huì)造成細(xì)菌細(xì)胞的破損（磁場(chǎng)導(dǎo)致細(xì)胞表面磁珠互相吸引，使細(xì)胞受到擠壓甚至破裂），導(dǎo)致分離的失敗；（7）磁珠偶聯(lián)抗體時(shí)，一般采用疏水吸附或化學(xué)偶聯(lián)方式將具有活性的抗體連接在磁珠表面。若抗體與磁珠表面距離太近，因磁珠本身性質(zhì)及其表面殘留的疏水或強(qiáng)親水基團(tuán)，容易引起抗體空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致抗體生物活性下降。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種捕獲效率高、簡(jiǎn)便分離時(shí)間短，低梯度磁場(chǎng)下（小于30?T/m）復(fù)雜的食品基質(zhì)中目的菌（金黃色葡萄球菌）特異性快速分離的方法。包括如下步驟：

金黃色葡萄球菌分離的方法，包括以下步驟：

（1）每稱取1.0?mg樹狀分子，懸浮于4?mL?0.01?mol/L，pH?8.0?PBS磷酸緩沖液中，攪拌滴加25%的戊二醛水溶液?545?μL，使戊二醛的終濃度為3%，在搖床150?r/min的轉(zhuǎn)速下室溫反應(yīng)3.5?h?；滴加金黃色葡萄球菌SA特異性抗體1?mL，使其終濃度達(dá)到3?mg/mL左右；搖床150?r/min?的轉(zhuǎn)速下室溫反應(yīng)24?h；減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結(jié)束將得到的溶液冷凍干燥得樹狀分子-抗體復(fù)合物；（2）取15?mg?長(zhǎng)鏈生物素，懸浮于4?mL?0.01?mol/L，pH?8.0?PBS磷酸緩沖液中，攪拌滴加25%的戊二醛水溶液545?μL，使戊二醛的終濃度為3%；在搖床150?r/min的轉(zhuǎn)速下室溫反應(yīng)3.5?h?；加入0.53?mg步驟（1）所得樹狀分子-抗體復(fù)合物，在搖床150?r/min的轉(zhuǎn)速下室溫反應(yīng)24?h；減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結(jié)束將得到的溶液冷凍干燥得長(zhǎng)鏈生物素-樹狀分子-抗體復(fù)合物；（3）取1?mL待測(cè)樣品溶液，加入0.1?mg?SA抗體和長(zhǎng)鏈生物素共修飾的樹狀分子即步驟（2）長(zhǎng)鏈生物素-樹狀分子-抗體復(fù)合物，置于混勻儀上，以30?rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育15?min，加入0.1?mg修飾有鏈霉親和素的納米磁珠，置于混勻儀上，以30?rpm的轉(zhuǎn)速在室溫孵育15?min；常規(guī)磁力架分離3?min；（4）去離子水輕輕清洗后，用PBS緩沖液混重懸即得富集有金黃色葡萄球菌的納米磁珠-鏈霉親和素-長(zhǎng)鏈生物素-樹狀分子-抗體-SA復(fù)合物。