[發明專利]志賀氏菌在復雜基質中磁富集分離方法

有效

• 申請號: 201310219457.7
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103308680A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 賴衛華;山珊;劉道峰;徐超蓮;陳明慧
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/577
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體是涉及基于納米磁珠的志賀氏菌分離方法。

背景技術

志賀氏菌通稱痢疾桿菌，屬于革蘭氏陰性細胞內致病菌，在我國感染性腹瀉病原菌中居首位。志賀氏菌主要通過消化道途徑傳播，侵襲腸上皮細胞，引起以發熱、腹痛、腹瀉為特征的典型的痢疾癥狀。每年全球有1.6億人患病，而志賀氏菌感染的高發人群最主要為l-4歲的兒童。在成年患者中，10～100?cfu志賀氏菌就可通過感染腸道致病，建立一種高效快速檢測鼠傷寒沙門氏菌的新方法顯得尤為迫切，鑒于需要建立一種高效，快速的檢測方法，免疫磁分離技術在食源性致病菌監測中得到了迅速發展

免疫磁分離技術是食源性致病菌快速篩查技術的重要組成部分之一，該技術可高效捕獲、濃縮增菌液中目標菌、提高致病菌檢測靈敏度和縮短檢測時間。近年來，基于磁性微珠的免疫磁分離法（IMS）將目標菌抗體連接到磁珠上，然后將連有抗體的磁珠投入樣品液中對目標菌進行捕獲、富集，磁分離（具體原理見圖2A）。然而，目前該基于微米級免疫磁珠的分離技術存在諸多局限性：1）微米磁珠的比表面積相對較小，降低了磁珠捕獲效率；2）由于微米磁珠自身的顆粒性質，其與細菌細胞之間通過多相反應（multiphase?reaction）結合，通常需要更長的時間去特異性捕獲食品基質中的細菌細胞；3）微米磁珠單分散性較差，在食品基質液中容易發生自身聚集或形成沉淀；4）傳統的免疫磁分離技術，往往是將抗體分子直接偶聯于免疫磁珠上，此過程常常會導致抗體的活性大大地降低并且導致抗體的空間方向發生改變增大了抗體間的空間位阻效應，從而降低了抗體的捕獲效率5）食品基質性質復雜并且其中非目的致病菌的雜菌濃度大，微米磁珠容易產生非特異性吸附，難以實現對食品樣液中目的菌的特異性分離；6）微米磁珠的濃度過高會造成細菌細胞的破損（磁場導致細胞表面磁珠互相吸引，使細胞受到擠壓甚至破裂），導致分離的失敗；7）磁珠偶聯抗體時，一般采用疏水吸附或化學偶聯方式將具有活性的抗體聯接在磁珠表面。抗體與磁珠表面距離太近，磁珠本身性質及其表面殘留的疏水或強親水基團容易引起抗體空間構象發生改變，導致抗體生物活性下降。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種捕獲效率高、簡便、分離時間短，低梯度磁場下（小于30?T/m）從復雜的食品基質中快速、特異分離目的菌志賀氏菌的方法。

志賀氏菌在復雜基質中磁富集分離方法，包括以下步驟：

（1）每取1?mg超支化聚合物溶解于2?mL?0.02?M，pH?6.5磷酸緩沖液PBS，加入0.6?mg?N-羥基丁二酰亞胺NHSS，0.4?mg?乙基3-（3-二甲氨基）碳二亞胺鹽酸鹽EDC，室溫置于混勻儀上攪拌，活化15?min；加入18.75?mg志賀氏菌特異性抗體，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥得超支化聚合物-抗體復合物；

（2）取15?mg?長鏈生物素，3.6?mg?NHSS，2.4?mg?EDC溶解于2?mL?0.02?M?pH?6.5?PBS緩沖液中；加入0.33?mg超支化聚合物-抗體復合物加入到上述溶液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥得長鏈生物素-超支化聚合物-抗體復合物；

（3）取1mL?待測樣品溶液，加入0.1?mg志賀氏菌抗體和長鏈生物素共修飾的超支化聚合物即步驟（2）長鏈生物素-超支化聚合物-抗體復合物，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速室溫孵育15?min；加入0.1?mg修飾有鏈霉親和素的納米磁珠，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速再室溫孵育15?min，常規磁力架分離3?min；

（4）磁力分離后，0.1%?PBST洗滌后，用PBS緩沖液重懸即得捕獲有志賀氏菌的納米磁珠-鏈霉親和素-長鏈生物素-超支化聚合物-抗體-志賀氏菌抗原復合物。

所述超支化聚合物為氨基化的超支化聚酰胺-胺，其分子量為8000?Da。結構如圖1。

所述納米磁珠粒徑為20-50nm，優選為30?nm。

超支化聚合物通過氨基和志賀氏菌特異性抗體的羧基實現超支化聚合物和抗體的共價偶聯。

超支化聚合物通過氨基和長鏈生物素分子的羧基，實現超支化聚合物和長鏈生物素的共價偶聯；加入過量長鏈生物素以保證封閉超支化聚合物上裸露的氨基位點。

具體原理見圖2B。