[發明專利]一種富集分離人外周血CD34+和CD91+淋巴細胞的方法

有效

• 申請號: 201310219417.2
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103305462A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 許恒毅;傅芬;黃小林;劉雯婷;范麗娟;熊勇華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，具體是涉及基于納米磁珠的CD34⁺和CD90⁺干細胞分離方法。

背景技術

干細胞分離和純化是研究干細胞各種生物學特性的基本手段，有潛在的臨床治療價值。目前認為CD34⁺細胞是較早期的干細胞，但CD34⁺細胞是異質性的，其中多能干細胞只占一小部分，更原始的部分應該是CD34⁺/CD90⁺等。純化出這些更原始的部分進行體外培養，才能更加真實地了解原始造血干細胞的特性和增殖、分化特征。然而，正常人外周血中CD34⁺和CD90⁺干細胞的含量很低，現有方法還無法對外周血中痕量CD34⁺和CD90⁺干細胞直接分離和采集。因此，建立一種高效分離和純化人外周血中CD34⁺和CD90⁺干細胞的方法，并對其進行表型及生物學功能鑒定，為更好的研究CD34⁺和CD90⁺干細胞的功能提供基礎。

免疫磁分離技術是外周血細胞快速分離富集技術的重要組成部分之一，該技術可高效捕獲、濃縮人外周血樣品中靶細胞，提高靶細胞檢測靈敏度。近年來，基于磁性微珠的免疫磁分離法（IMS）是將抗體連接到磁珠上，然后再將連有抗體的磁珠投入樣品液中對目標細胞進行捕獲、富集以及磁分離（具體原理見圖2A）。然而，目前基于微米級免疫磁珠的分離技術存在諸多局限性：1）與納米磁珠相比，微米磁珠的比表面積相對較小，降低了磁珠捕獲效率；2）由于微米磁珠自身的顆粒性質，其與細胞之間通過多相反應（multiphase?reaction）結合，通常需要更長的時間去特異性捕獲食品基質中的細胞；3）微米磁珠單分散性較差，在外周血基質中容易發生自身聚集或形成沉淀；4）傳統的免疫磁分離技術，往往是將抗體直接偶聯于免疫磁珠上，此操作常常會引起抗體活性大幅度降低以及導致抗體的空間方向發生改變，并增大了抗體間的空間位阻效應，從而降低了抗體的捕獲效率5）血液粘稠度高并且其中非CD34⁺和CD90⁺干細胞的血細胞濃度大，微米磁珠容易產生非特異性吸附，難以實現對血液中CD34⁺和CD90⁺干細胞的特異性分離；6）微米磁珠的濃度過高會造成CD34⁺和CD90⁺干細胞的破損（磁場導致細胞表面磁珠互相吸引，使細胞受到擠壓甚至破裂），導致分離的失敗；7）磁珠偶聯抗體時，一般采用疏水吸附或化學偶聯方式將具有活性的抗體聯接在磁珠表面。抗體與磁珠表面距離太近，磁珠本身性質及其表面殘留的疏水或強親水基團容易引起抗體空間構象發生改變，導致抗體生物活性下降。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種捕獲效率高、簡便分離時間短，低梯度磁場下（小于30?T/m）復雜的外周血基質中CD34⁺和CD90⁺干細胞特異性快速分離的方法。包括如下步驟：

一種富集分離人外周血CD34⁺和CD91⁺淋巴細胞的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）每取1.0?mg多臂井星聚合物溶解于2?mL，0.02?M，pH?6.5?PBS，加入0.6?mg?NHSS，0.4?mg?EDC，室溫置于混勻儀上攪拌，活化15?min；取2.14?mg?鼠抗人CD34⁺抗體加入上述反應液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥得多臂井星聚合物-鼠抗人CD34⁺抗體復合物。

（2）每取1.0?mg多臂井星聚合物溶解于2?mL，0.02?M，pH?6.5?PBS，加入0.6?mg?NHSS，0.4?mg?EDC，室溫置于混勻儀上攪拌，活化15?min；取2.14?mg?鼠抗人CD90⁺抗體加入上述反應液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥；