[發明專利]一種富集分離人外周血CD34+和CD91+淋巴細胞的方法

有效

• 申請號: 201310219417.2
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103305462A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 許恒毅;傅芬;黃小林;劉雯婷;范麗娟;熊勇華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

1.一種富集分離人外周血CD34⁺和CD91⁺淋巴細胞的方法，其特征在于包括以下步驟：（1）每取1.0?mg多臂井星聚合物溶解于2?mL，0.02?M，pH?6.5?PBS，加入0.6?mg?NHSS，0.4?mg?EDC，室溫置于混勻儀上攪拌，活化15?min；取2.14?mg?鼠抗人CD34⁺抗體加入上述反應液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥得多臂井星聚合物-鼠抗人CD34⁺抗體復合物；（2）每取1.0?mg多臂井星聚合物溶解于2?mL，0.02?M，pH?6.5?PBS，加入0.6?mg?NHSS，0.4?mg?EDC，室溫置于混勻儀上攪拌，活化15?min；取2.14?mg?鼠抗人CD90⁺抗體加入上述反應液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥；（3）每取22.5?mg?長鏈生物素，5.4?mg?NHSS，3.6?mg?EDC溶解于3?mL?0.02?M?pH?6.5?PBS緩沖液中；將0.8?mg多臂井星聚合物-抗體復合物加入到上述溶液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥得相應長鏈生物素-多臂井星聚合物-抗體復合物；（4）富集捕獲：取待測樣品溶液1mL，加入0.1?mg?長鏈生物素-多臂井星聚合物-CD34⁺抗體復合物，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速室溫孵育15?min形成長鏈生物素-多臂井星聚合物-抗體-CD34⁺細胞抗原復合物；加入0.1?mg修飾有鏈霉親和素的納米磁珠，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速再室溫孵育15?min，將離心管插入常規磁力架充分分離；磁分離后，用等體積的PBS溶液重懸細胞，即為CD34⁺細胞；將分離后的上清液用等體積的PBS溶液洗滌，離心300rpm/min，20℃?10?min，棄去上清，用等體積的PBS溶液重懸細胞；加入0.1?mg?長鏈生物素-多臂井星聚合物-CD90⁺抗體復合物，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速室溫孵育15?min形成長鏈生物素-多臂井星聚合物-抗體-CD90⁺細胞抗原復合物；加入0.1?mg修飾有鏈霉親和素的納米磁珠，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速再室溫孵育15?min，將離心管插入常規磁力架充分分離，即得到CD90⁺細胞；（5）去離子水輕輕清洗后，用PBS緩沖液混重懸即得富集有CD34⁺或CD90⁺細胞的復合物即納米磁珠-鏈霉親和素-生物素-多臂井星聚合物-抗體-CD34⁺或CD90⁺細胞抗原。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述多臂井星聚合物為多臂井星化聚酰胺-胺，其分子量為?70000?Da。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述修飾了鏈霉親和素的納米磁珠粒徑為20-50?nm?，優選為30?nm。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2）所述外周血干細胞的采集的方法包括如下步驟：用COBE.Spectra.AutoPBMC^TM干細胞采集儀，輸入病人身高、體重、紅細胞壓積，液體參數：起始液體為1000?mL?9?g/L?NaCl，血漿收集體積和干細胞收集體積均設為100?mL，起始抗凝劑比例1:13，收集速度50?mL/min。