[發明專利]一種富集分離幽門螺桿菌的方法

無效

• 申請號: 201310219396.4
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103275902A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 魏華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;G01N33/569;C12R1/01
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體是涉及基于納米磁珠的食源性致病菌分離方法。

背景技術

食源性致病菌污染是我國食品安全的重大問題之一。據WHO統計，發達國家每年約有三分之一的人感染食源性疾病，全世界每年有220萬人因患食源性疾病而喪生。在我國，每年食物中毒例數在20～40萬人，除意外事故外，大部分均由食源性致病菌引起。幽門螺桿菌(Helicobacter?Pylor,?HP)是微需氧菌，環境氧要求5～8%，在大氣或絕對厭氧環境下不能生存，但可通過手、不潔食物、不潔餐具、糞便等途徑傳染，是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤和胃癌的主要致病菌。1994年世界衛生組織/國際癌癥研究機構（WHO/IARC）將幽門螺桿菌定為Ⅰ類致癌原。因此，在食源性致病菌檢測方面，發展快速、高效富集分離樣品中幽門螺桿菌的技術都是極有必要。?

免疫磁分離技術是食源性致病菌快速篩查技術的重要組成部分之一，該技術可高效捕獲、濃縮增菌液中目標菌，提高致病菌檢測靈敏度。近年來，基于磁性微珠的免疫磁分離法（IMS）將目標菌抗體連接到磁珠上，然后將連有抗體的磁珠投入樣品液中對目標菌進行捕獲、富集，磁分離（具體原理見圖2A）。然而，目前該基于微米級免疫磁珠的分離技術存在諸多局限性：1）微米磁珠的比表面積相對較小，降低了磁珠捕獲效率；2）由于微米磁珠自身的顆粒性質，其與細菌細胞之間通過多相反應（multiphase?reaction）結合，通常需要更長的時間去特異性捕獲食品基質中的細菌細胞；3）微米磁珠單分散性較差，在食品基質液中容易發生自身聚集或形成沉淀；4）傳統的免疫磁分離技術，往往是將抗體分子直接偶聯于免疫磁珠上，此過程常常會導致抗體的活性大大地降低并且導致抗體的空間方向發生改變增大了抗體間的空間位阻效應，從而降低了抗體的捕獲效率5）食品基質性質復雜并且其中非目的致病菌的雜菌濃度大，微米磁珠容易產生非特異性吸附，難以實現對食品樣液中目的菌的特異性分離；6）微米磁珠的濃度過高會造成細菌細胞的破損（磁場導致細胞表面磁珠互相吸引，使細胞受到擠壓甚至破裂，導致分離的失敗。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種簡便、捕獲效率高、分離時間短，低梯度磁場下（小于30?T/m）能從復雜的食品基質中快速、特異性分離目的菌幽門螺桿菌的方法。

一種富集分離幽門螺桿菌的方法，包括以下步驟：(1)?每稱取4.5?mg樹狀超支聚合物，溶解于4?mL磷酸緩沖液（PBS，0.01?mol/L，pH?8.0）中，攪拌滴加25%的戊二醛水溶液545?μL，使戊二醛的終濃度為3%。在搖床150?r/min的轉速下室溫反應3.5?h；滴加12?mg幽門螺桿菌HP特異性抗體，使其終濃度達到?3?mg/mL左右，搖床150?r/min?的轉速下室溫反應24?h；減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥得樹狀超支聚合物-抗體復合物；（2）取15?mg?長鏈生物素，溶解于4?mL?0.01?mol/L?pH?8.0?PBS磷酸緩沖液中，攪拌滴加25%的戊二醛水溶液545?μL，使戊二醛的終濃度為3%。在搖床150?r/min的轉速下室溫反應3.5?h；加入0.55?mg樹狀超支聚合物-抗體復合物，在搖床150?r/min的轉速下室溫反應24?h；減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥得長鏈生物素-樹狀超支聚合物-抗體復合物；（3）取1?mL待測樣品溶液，加入0.1?mg?HP抗體和長鏈生物素共修飾的樹狀超支聚合物即步驟（2）長鏈生物素-樹狀超支聚合物-抗體復合物，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速室溫孵育15?min；加入0.1?mg修飾有鏈霉親和素的納米磁珠，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速室溫孵育15?min，插入常規磁力架分離3?min；（4）磁力分離后，用0.1%?PBST洗滌后，用PBS緩沖液重懸即得捕獲有幽門螺桿菌的納米磁珠-鏈霉親和素-長鏈生物素-樹狀超支聚合物-抗體-HP抗原復合物。

所述樹狀超支聚合物為氨基化的樹枝狀化聚酰胺-胺，其分子量為56000?Da。結構如圖1。

所述納米磁珠粒徑為20-50nm，優選為30?nm。

超支聚合物通過氨基和HP特異性抗體的羧基實現樹狀超支聚合物和抗體的共價偶聯。