[發明專利]微量循環腫瘤細胞的分離方法

無效

• 申請號: 201310219229.X
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103275934A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 許恒毅
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體是涉及基于納米磁珠的循環腫瘤細胞分離方法。

背景技術

循環腫瘤細胞（circulating?tumor?cells，CTCs）是指進入人體外周血的腫瘤細胞。國外研究發現，腫瘤患者的外周血中CTCs的出現往往早于可見的實體瘤。因此，CTCs的檢測已被廣泛應用于腫瘤患者體外早期診斷。然而，腫瘤患者早期外周血中?CTCs數量十分稀少，現有方法還無法對外周血中痕量?CTCs?直接檢測。因此，實現人體外周血中CTCs?的高效富集，使之達到檢測方法靈敏度要求，不僅對腫瘤的早期發現，還對腫瘤患者化療藥物的快速評估、個體化治療（臨床篩藥、耐藥性的檢測）、腫瘤復發的監測以及腫瘤新藥的開發具有重要指導意義。

免疫磁分離技術是循環腫瘤細胞快速分離富集技術的重要組成部分之一，該技術可高效捕獲、濃縮全血樣品中腫瘤細胞，提高腫瘤細胞檢測靈敏度。近年來，基于磁性微珠的免疫磁分離法（IMS）將特異性物質連接到磁珠上，然后將連有特異性物質的磁珠投入樣品液中對目標細胞進行捕獲、富集，磁分離（具體原理見圖2A）。然而，目前該基于微米級免疫磁珠的分離技術存在諸多局限性：1）微米磁珠的比表面積相對較小，降低了磁珠捕獲效率；2）由于微米磁珠自身的顆粒性質，其與細胞之間通過多相反應（multiphase?reaction）結合，通常需要更長的時間去特異性捕獲全血基質中的細胞；3）微米磁珠單分散性較差，在全血基質中容易發生自身聚集或形成沉淀；4）傳統的免疫磁分離技術，往往是將特異性物質直接偶聯于免疫磁珠上，此過程常常會導致特異性物質的活性大大地降低，并且導致特異性物質的空間方向發生改變，從而增大特異性物質間的空間位阻效應，降低特異性物質的捕獲效率；5）血液粘稠度高并且其中非?CTCs的血細胞濃度大，微米磁珠容易產生非特異性吸附，難以實現對血液中CTCs的特異性分離；6）微米磁珠的濃度過高會造成CTCs的破損（磁場導致細胞表面磁珠互相吸引，使細胞受到擠壓甚至破裂），導致分離的失敗；（7）磁珠偶聯抗體時，一般采用疏水吸附或化學偶聯方式將具有活性的抗體聯接在磁珠表面。抗體與磁珠表面距離太近，磁珠本身性質及其表面殘留的疏水或強親水基團容易引起抗體空間構象發生改變，導致抗體生物活性下降。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種捕獲效率高、簡便分離時間短，低梯度磁場下（小于30?T/m）復雜的全血基質中CTCs特異性快速分離的方法。

微量循環腫瘤細胞的分離方法，包括以下步驟：氨基化樹狀分子與循環腫瘤細胞相應的特異性物質偶聯，摩爾投料比為1:1，形成樹狀分子-特異性物質復合物；

（1）將樹狀分子-特異性物質復合物與長鏈生物素偶聯，加入過量長鏈生物素以封閉樹狀分子上裸露的氨基位點，形成長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質復合物;

（2）將上述長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質復合物溶液加入到全血樣品溶液中，以捕獲全血樣品溶液中的CTCs，形成長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質-CTCs復合物；

（3）將修飾有鏈霉親和素的納米磁珠加入到上述混合溶液中通過鏈霉親和素與長鏈生物素的親和作用捕獲長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質-CTCs復合物，以形成終復合物納米磁珠-鏈霉親和素-長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質-CTCs；

（4）將終復合物溶液磁力分離，去離子水輕輕清洗后，用PBS緩沖液重懸即得富集有CTCs的磁珠。

所述樹狀分子為氨基化的聚酰胺-胺型樹枝狀高分子PAMAM-G4，其分子量為14215?Da。結構如圖1。

步驟（1）中樹狀分子通過氨基和特異性物質的羧基實現樹狀分子和特異性物質的共價偶聯。

步驟（2）中樹狀分子通過氨基和長鏈生物素分子的羧基，實現樹狀分子和長鏈生物素的共價偶聯；加入過量長鏈生物素以保證封閉樹狀分子上裸露的氨基位點。

所述修飾了鏈霉親和素的納米磁珠粒徑為20-50?nm，優選為30?nm。